肝移植術(shù)后受者依維莫司血藥濃度檢測(cè)體系的建立

陶斯湄 黃際薇 李海波 張英才 楊揚(yáng)

由于移植技術(shù)和免疫抑制劑的快速發(fā)展，肝移植術(shù)后移植物的5年存活率已達(dá)70%以上[1-3]，但是長(zhǎng)期應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）常引起腎損傷、糖尿病、高血壓、神經(jīng)毒性損傷等不良反應(yīng)[4-6]。如何在有效免疫抑制狀態(tài)下，減少CNI類藥物的用量，從而減輕腎損傷等不良反應(yīng)是移植學(xué)界的普遍共識(shí)[7]。

依維莫司已分別于2012年和2013年在歐洲和美國(guó)上市，是一種哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑，是西羅莫司的羥乙基衍生物[8-9]。其藥物作用機(jī)制與西羅莫司相似，不僅抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，還能減少血管生成[10-12]。臨床研究表明，肝移植受者無(wú)論是在術(shù)后早期應(yīng)用依維莫司（術(shù)后1個(gè)月）或是在術(shù)后半年由其他CNI切換，均可有效保護(hù)腎功能[13-16]。此外，依維莫司還被認(rèn)為具有抗腫瘤效果，盡管目前的研究結(jié)果表明該結(jié)論仍存在一定爭(zhēng)議[17-18]。由于依維莫司的臨床安全治療窗較窄（血藥谷濃度3～8 ng/mL）[19-20]，因此肝移植術(shù)后應(yīng)用依維莫司的受者需要常規(guī)監(jiān)測(cè)血藥濃度以調(diào)整服藥劑量[21-22]。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)肝移植受者術(shù)后依維莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)方法的研究尚屬空白。本研究通過(guò)建立一種快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)體系測(cè)定人全血中依維莫司濃度，確定其準(zhǔn)確度，旨在建立適用于中國(guó)肝移植術(shù)后受者依維莫司血藥濃度的監(jiān)測(cè)方法，為臨床個(gè)體化治療提供決策依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院和外院肝移植術(shù)后正在服用依維莫司的5例受者的外周血樣本5份，其中我院1例，外院4例，均為肝移植術(shù)后原發(fā)性肝癌（肝癌）復(fù)發(fā)受者，受者自行購(gòu)藥服用并自愿參加我院的免費(fèi)依維莫司濃度檢測(cè)，均已簽署知情同意書(shū)。受者男4例，女1例，平均年齡為52歲。其中外院4例受者于中國(guó)香港購(gòu)藥，藥品規(guī)格為每粒1 mg，給藥頻次為每次1 mg，每日2次，開(kāi)始服藥時(shí)間為術(shù)后6～14個(gè)月；我院的1例受者服用國(guó)內(nèi)已上市藥物，藥品規(guī)格為每粒5 mg，給藥頻次為每次2.5 mg，每日1次，開(kāi)始服藥時(shí)間為術(shù)后13個(gè)月。

5例受者中，其中我院1例于術(shù)后22個(gè)月，外院4例于術(shù)后8～19個(gè)月進(jìn)行樣本采集，均為服藥前1 h內(nèi)，于空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝。

1.2 試劑和儀器

無(wú)藥物全血（德國(guó)Recipe公司）；依維莫司標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)K1802090，北京阿拉丁公司）；內(nèi)標(biāo)物為依維莫司-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)FN10251906，德國(guó)Merck公司）；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）級(jí)甲醇（德國(guó)Merck公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏公司）；質(zhì)譜級(jí)甲酸（美國(guó)Fisher公司）；HPLC級(jí)甲酸銨（美國(guó)Sigma公司）。

4500 Qtrap三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB science公司）；LC-30AD超高壓二元梯度系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；Basic型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；3-18KS高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；數(shù)據(jù)分析處理軟件為AnalystV1.5.2工作站（美國(guó)AB science公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 采用Phenomenex Kinetex PFP色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）[10]，柱溫：50 ℃；流速：1 mL/min；流動(dòng)相A：水（含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：甲醇（含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸）；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，其中0～0.5 min，80%A，0.5～1.5 min，80% 到5%A，保持1.5 min，3～3.01 min，5%～80%A，保持1.5 min，停止；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)定為10 ℃。該方法的總運(yùn)行時(shí)間為4.5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI源）；離子極性 ：正離子模式；掃描方法：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；依維莫司和內(nèi)標(biāo)物的檢測(cè)離子對(duì)分別為核質(zhì)比（m/z）975.6 → 908.6，m/z 979.6 → 912.6；兩者使用相同的碰撞能量、正離子模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞室射出電壓，分別為25、71、20 V。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品依維莫司10 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液，作為貯備液。依維莫司工作溶液由儲(chǔ)備溶液制得，濃度分別為1、10、100、1 000 μg/mL。內(nèi)標(biāo)物依維莫司-D4工作溶液的濃度為15 ng/mL。儲(chǔ)備液和所有工作溶液配置后放置于4℃冰箱中保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)樣本（standard，STD）和質(zhì)量控制樣本（quality control，QC）是用無(wú)藥物全血加入依維莫司的工作溶液中制備得到。STD線性范圍為1～100 ng/mL。QC分為低、中、高3個(gè)水平，濃度分別為3.31、13.00、41.50 ng/mL。STD和QC配置后裝入1.5 mL聚丙烯管中，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.4 樣本前處理 在體積為100 μL的乙二胺四乙酸抗凝全血中分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液、20 μL硫酸鋅（0.5 mol/L）和200 μL甲醇后，渦旋混合30 s。然后將樣品放在-20 ℃中保持5 min以完成蛋白質(zhì)沉淀并于4 ℃下以23 950×g離心7 min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用STD依維莫司峰面積/依維莫司-D4 峰面積（y）和依維莫司濃度/依維莫司-D4濃度（x）進(jìn)行線性回歸（1/x2）分析，計(jì)算校準(zhǔn)函數(shù)。5例樣本的依維莫司血藥谷濃度通過(guò)測(cè)得其峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積、內(nèi)標(biāo)物濃度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算得出。

2 結(jié) 果

2.1 依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線及QC數(shù)據(jù)

在定量范圍為1～100 ng/mL的情況下，質(zhì)控準(zhǔn)確度都在15%以內(nèi)，各分析物在標(biāo)準(zhǔn)曲線S1點(diǎn)和實(shí)際樣本中均無(wú)明顯干擾，峰形良好（表1）。

表1 依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)控的準(zhǔn)確度結(jié)果Table 1 Accuracy results of quality control of everolimus standard curve

2.2 依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性分析

依維莫司的回歸方程為y=0.0556x-0.00195（R2=0.998），依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）＞0.99，表明依維莫司在血藥濃度1～100 ng /mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于該藥物在全血中的含量測(cè)定（圖1）。

圖1 依維莫司的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of everolimus

2.3 依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用

使用依維莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得5個(gè)臨床樣本的依維莫司血藥谷濃度范圍為3.77～9.27 ng/mL，均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。根據(jù)文獻(xiàn)[ 17]，依維莫司的有效血藥谷濃度范圍為3～8 ng/mL。本研究測(cè)得的5例受者的依維莫司血藥谷濃度，4例在治療窗內(nèi)，1例血藥谷濃度＞8 ng/mL（表2）。

表2 5例肝移植受者的依維莫司血藥谷濃度檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of everolimus trough blood concentration in 5 liver transplant recipients

3 討 論

既往的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，依維莫司血藥谷濃度≥3.0 ng/mL才能夠發(fā)揮免疫抑制作用，減少排斥反應(yīng)的發(fā)生；而血藥谷濃度＞8 ng/mL可導(dǎo)致藥物相關(guān)不良反應(yīng)增加，包括脂代謝異常、蛋白尿和血細(xì)胞三系減少等[23-27]。因此，推薦的依維莫司血藥谷濃度范圍為3～8 ng/mL[28]。與西羅莫司相比，依維莫司的優(yōu)點(diǎn)包括具有更短的半衰期（約60 h 比30 h）和血藥濃度更快到達(dá)穩(wěn)態(tài)水平（6 d比4 d）[29]。鑒于這些特點(diǎn)，臨床應(yīng)用中依維莫司的劑量較容易調(diào)整，并且不需要負(fù)荷劑量[30-31]。但是，依維莫司有效的血藥谷濃度窗口相對(duì)較窄，為3～8 ng/mL。因此，建立準(zhǔn)確易用的依維莫司血藥濃度測(cè)定方法對(duì)肝移植受者術(shù)后的藥物劑量調(diào)整和個(gè)體化醫(yī)療決策選擇具有重要意義[32-35]。

在本研究中，筆者開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一個(gè)簡(jiǎn)單的樣品制備方案，與以往報(bào)道相比[36-37]，本研究?jī)H用甲醇和硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，無(wú)需固相萃取或氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶等樣本前處理方法；只需100 μL全血，無(wú)需復(fù)雜的樣品制備即可達(dá)到足夠的定量下限。在總運(yùn)行時(shí)間4.5 min內(nèi)獲得了良好的線性關(guān)系和較高的準(zhǔn)確度。本研究建立的UPLC-MS/MS測(cè)定肝移植受者中依維莫司血藥濃度的方法準(zhǔn)確度高、樣品處理方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短，適用于依維莫司的治療藥物監(jiān)測(cè)。未來(lái)還需進(jìn)一步對(duì)該方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)和遺留效應(yīng)等進(jìn)行驗(yàn)證，為該藥臨床精準(zhǔn)應(yīng)用作鋪墊。