流動相對西羅莫司異構體在反相液相色譜上分離效果影響的研究*

鄭權，李萍，儲照偉，樊瑜波,2△

(1.北京航空航天大學 生物與醫(yī)學工程學院 生物力學與力生物學教育部重點實驗室，北京 100191；2.國家康復輔具研究中心，北京 100176)

1 引 言

西羅莫司(Sirolimus)，又名雷帕霉素(Rapamycin)，是從吸水性鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的培養(yǎng)液中分離出來的一種天然抗生素[1]。西羅莫司具有免疫抑制與抗平滑肌細胞增殖等功能，其載藥洗脫支架可明顯降低冠心病介入治療后的再狹窄率，且治療效果直接依賴于西羅莫司的釋放動力學[2]。因此，體外藥物釋放動力學的測定是西羅莫司洗脫支架質(zhì)量控制的強制性要求。同時，在西羅莫司的體外釋放動力學基礎上，結合人體冠脈的血流動力學[3]與物質(zhì)在人體血管中的傳輸模型[4]，通過計算流體力學方法，可間接獲得西羅莫司在人體冠脈組織的濃度分布，從而解決了無法直接測試人體冠脈組織中藥物濃度分布的難題[5-6]。準確測試西羅莫司洗脫支架的體外藥物釋放動力學對于質(zhì)量控制與冠脈組織內(nèi)藥物分布的建模具有非常重要的意義。

西羅莫司的分子結構非常復雜，它是由31元環(huán)組成的大環(huán)三烯內(nèi)酯化合物，且含有15個立體異構中心，導致西羅莫司在溶液中存在構象異構體[7]。在高效液相色譜的譜圖上，西羅莫司的異構體可能出現(xiàn)3個色譜峰(按照洗脫時間的先后順序)：α峰含量極微，低于1%；β峰是主峰，約占92%；γ峰是次峰，約占7%[8]。為了使高效液相色譜法能夠準確測定西羅莫司的含量，需要將β峰與γ峰完全分離[9]。雖然目前廣泛采用高效液相色譜法測定西羅莫司的含量[10-13]，但只有少數(shù)文獻報道了西羅莫司異構體在高效液相色譜上的分離效果：采用反相色譜柱，在合適的柱溫下，以一定比例的水/甲醇[8]或水/乙腈[9]作流動相能夠分離西羅莫司異構體。由于流動相可能對西羅莫司異構體的分離效果具有顯著的影響；同時，與色譜柱和柱溫相比，流動相種類與比例的選擇更為多樣化與靈活，可方便用于西羅莫司異構體最佳分離條件的優(yōu)化。目前還沒有文獻深入討論不同流動相對西羅莫司異構體分離效果的影響。本研究在色譜柱與柱溫都相同的實驗條件下，對比研究水/乙腈與水/甲醇作為流動相對西羅莫司異構體分離效果的影響，以期找到一種快速且高效分析西羅莫司的液相色譜方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

美國Waters 600高效液相色譜儀包括：四元溶劑梯度輸送泵，Waters 2487雙波長吸收檢測器，Empower色譜軟件管理系統(tǒng)。反相色譜柱是日本YMC J’sphere ODS-H80，色譜柱的規(guī)格是4.6 mm × 250 mm。色譜柱恒溫箱采用HT-220A(天津恒奧公司)。色譜純甲醇與乙腈均購自天津四友公司。西羅莫司由福建科瑞藥業(yè)有限公司提供。實驗用水為超純水。

2.2 實驗方法

參照文獻所使用的柱溫[10-13]，結合色譜柱廠家說明書所推薦的溫度范圍，色譜柱的溫度設為50°C。色譜流動相分別采用不同體積比例的二元溶劑混合物水/乙腈(40/60, 35/65, 30/70, v/v)或水/甲醇(20/80, 15/85, 10/90，v/v)。流動相流速設為1.0 mL/min。西羅莫司用乙腈配成1.0 mg/mL作為樣品溶液，進樣量為20.0 uL，紫外檢測波長選擇277 nm。

2.3 色譜峰分離度的計算

衡量兩個相鄰色譜峰分離效果用分離度(resolution,R)來表示，采用下列公式計算分離度：

R=2(tγ-tβ)/(Wβ+Wγ)

(1)

式中tβ和tγ分別為西羅莫司的β峰與γ峰的保留時間(retention time, t)，Wβ與Wγ分別為西羅莫司的β峰與γ峰的峰寬(peak width, W)。如果分離度R≥ 1.5，則表明兩個相鄰色譜峰完全分離[14]。由于β異構體的含量達90%以上，故將西羅莫司β異構體色譜峰的保留時間、峰寬與分離度作為判斷色譜分離效果的依據(jù)。建立一種快速且高效分析西羅莫司的色譜方法就是找到一種使西羅莫司β異構體色譜峰的保留時間短，峰寬狹窄且分離度高(R≥ 1.5)的實驗條件。

3 實驗結果與討論

3.1 不同體積比例水/乙腈流動相對西羅莫司分離效果的影響

流動相采用不同體積比例的水/乙腈混合物作為流動相，獲得西羅莫司的色譜峰見圖1。實驗獲得的色譜圖采用Empower 色諳軟件處理，從而獲得西羅莫司β異構體色譜峰與γ異構體色譜峰的保留時間與與峰寬，再根據(jù)式(1)，進一步通過計算獲得β峰與γ峰的分離度，結果見表1。實驗結果表明：隨著流動相中乙腈比例的提高，西羅莫司的β峰與γ峰的保留時間都變短，峰寬都變狹窄，但分離度也相應降低；在乙腈比例提高到70%時，則不能完全分離西羅莫司的β峰與γ峰，結果見表1。當水與乙腈的體積比為40/60或35/65，西羅莫司的β峰與γ峰均能達到完全分離；雖然在乙腈比例為60%，其分離度最高，但保留時間最長。綜合西羅莫司色譜峰的保留時間、峰寬與分離度，以水/乙腈混合物作流動相時，水/乙腈(35/65)是最佳條件，西羅莫司β峰的保留時間為20.75 min，峰寬為1.53 min，分離度為2.07。劉英等[9]采用水/乙腈(35/65, v/v)對西羅莫司異構體進行了分離，本文的結果與該文獻報道的結果相似。

圖1以不同體積比例的水/乙腈作流動相獲得的西羅莫司色譜圖

Fig1Chromatogramsofsirolimusobtainedusingmobilephaseswithdifferentvolumeratiosofwatertoacetonitrile

表1不同體積比例水/乙腈作流動相對西羅莫司異構體分離效果的影響

Table1Effectofwater/acetonitrilemobilephasesontheseparationofsirolimusisomers

水/乙腈 (v/v)保留時間/min tβ tγ峰寬/min Wβ Wγ 分離度(R) 40/6033.1038.072.35 1.64 2.49 35/6520.7523.571.531.20 2.07 30/70 13.9315.631.341.01 1.44

3.2 不同體積比例水/甲醇流動相對西羅莫司分離效果的影響

流動相采用不同體積比例的水/甲醇混合物，所獲得的西羅莫司的色譜峰見圖2。按照3.1所述的方法，通過計算獲得西羅莫司異構體的分離結果見表2。實驗結果表明：隨著流動相中甲醇比例的提高，西羅莫司的β峰與γ峰的保留時間都變短，峰寬都變狹窄，但分離度也相應降低；當甲醇比例提高到90%時，則不能完全分離西羅莫司的β峰與γ峰。在水與甲醇的體積比為20/80或15/85時，西羅莫司的β峰與γ峰均能達到完全分離；與水/甲醇(20/80, v/v)相比，水/甲醇(15/85, v/v)的保留時間顯著變短。因此，以水/甲醇混合物作流動相時，水/甲醇的適合比例是15/85，西羅莫司的β峰的保留時間為6.94 min，峰寬為0.45 min，分離度為2.77。Ricciutelli等人[8]也采用水/甲醇(20/80, v/v)作流動相完全分離了西羅莫司異構體；與該文獻相比，本研究以水/甲醇(15/85, v/v)作流動相所獲得的西羅莫司異構體的保留時間更短，峰寬更狹窄。

圖2以不同體積比例的水/甲醇作流動相獲得的西羅莫司色譜圖

Fig2Chromatogramsofsirolimusobtainedusingmobilephaseswithdifferentvolumeratiosofwatertomethanol

表2不同體積比例水/甲醇流動相對西羅莫司異構體分離效果的影響

Table2Effectofwater/methanolmobilephasesontheseparationofsirolimusisomers

水/甲醇 (v/v)保留時間/min tβ tγ峰寬/min Wβ Wγ 分離度(R) 20/8012.4015.690.79 0.81 4.11 15/85 6.948.270.450.51 2.77 10/90 4.795.250.290.35 1.44

無論在西羅莫司洗脫支架的研究開發(fā)或質(zhì)量控制過程中，都需要建立一種快速且分離度高的西羅莫司分析方法。從本研究結果可知，無論在水/乙腈混合物或水/甲醇混合物中，隨著有機溶劑比例的增加，西羅莫司的β峰與γ峰的保留時間都變短，峰寬都變狹窄，這是由西羅莫司的結構特征所決定的，西羅莫司的脂溶性極強，其水溶性很差(2.6 μg/mL)[15]，只有加大有機溶劑的比例才能將西羅莫司從反相色譜柱上洗脫下來；但隨著有機溶劑比例的增加，西羅莫司的分離度也相應降低。通過調(diào)整流動相水/乙腈的比例(35/65)或水/甲醇的比例(15/85)，都能夠完全分離西羅莫司的異構體。尤其值得注意的是，與水/乙腈(35/65, v/v)相比，采用水/甲醇(15/85, v/v)作流動相，不僅使西羅莫司β異構體色譜峰的保留時間縮短了約2倍，而且峰寬也變狹窄了2倍以上，其分離度也相應提高(表1、表2)。因此，對于西羅莫司異構體的分離效果，流動相選擇水/甲醇(15/85, v/v)顯著優(yōu)于水/乙腈(35/65, v/v)。

4 結論

本研究采用相同的色譜柱與柱溫，分別以不同體積比例的二元溶劑混合物水/乙腈或水/甲醇作流動相，用來對比研究不同流動相對西羅莫司異構體分離效果的影響。研究結果表明：在反相色譜柱上，以水/甲醇(15/85)為流動相，可快速且高效地分離西羅莫司異構體，是水/甲醇與水/乙腈流動相體系中的最佳條件。本研究獲得的西羅莫司異構體分離的色譜條件可為測試西羅莫司洗脫支架的體外藥物釋放動力學提供有力的檢測方法。