阿魏酸對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分泌 干細(xì)胞因子和成管分化的影響

肖慧 彭林娟 熊武 白雪 譚梅鑫 李葉蘭 楊瑩 朱晨鴻 鄒曉玲

〔摘要〕 目的 探討阿魏酸（ferulic acid， FA）對間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）增殖、分泌干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）和定向內(nèi)皮細(xì)胞成管分化的影響。方法 取足月健康新生兒臍帶血10 mL，采用密度梯度離心法得到單個(gè)細(xì)胞，并鑒定人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells， hUCBMSCs）分化能力。將hUCBMSCs分別用不同濃度梯度的FA（0、1、2、4、8、16 mg/L）干預(yù)以確定FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度。取hUCBMSCs隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度FA干預(yù)，對照組用等體積PBS液處理。分別采用CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Matrigel體外成管試驗(yàn)及ELISA法檢測兩組hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF的能力;采用免疫熒光法檢測hUCBMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化后CD31、vWF的表達(dá)情況。結(jié)果 （1）hUCBMSCs能成功誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞;（2）FA促進(jìn)hUCBMSCs增殖的最佳濃度為2 mg/L;（3）與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF能力顯著增強(qiáng)，且FA誘導(dǎo)成管分化后CD31和vWF的表達(dá)明顯增多（P<0.05）。結(jié)論 FA能促進(jìn)hUCBMSCs增殖及分泌SCF，同時(shí)能誘導(dǎo)hUCBMSCs成管分化，進(jìn)一步證實(shí)FA具有促進(jìn)血管新生的潛能。

〔關(guān)鍵詞〕 阿魏酸;間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞增殖;干細(xì)胞因子;成管分化;血管新生

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.005

Effects of Ferulic Acid on the Proliferation， Stem Cell Factor Secretion and Tube

Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

XIAO Hui1， PENG Linjuan1， XIONG Wu2， BAI Xue1， TAN Meixin1， LI Yelan1， YANG Ying1， ZHU Chenhong1， ZOU Xiaoling2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effects of ferulic acid （FA） on the proliferation， the secretion of stem cell factor （SCF） and the differentiation of targeted endothelial cells by mesenchymal stem cells （MSCs）. Methods Single nuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from cord blood of full-term healthy newborns， and the differentiation ability of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUCBMSCs） were identified. hUCBMSCs were intervened with FA with different concentration gradients （0， 1， 2， 4， 8， 16 mg/L） to determine the optimal concentration of FA to promote the proliferation of hUCBMSCs. hUCBMSCs were randomly divided into the experimental group and the control group. The experimental group was intervened with the best concentration of FA， the control group was treated with PBS solution of equal volume. CCK-8 cell proliferation test， Matrigel in vitro tube test and ELISA method were used to detect the proliferation， tube formation and SCF secretion ability of the two groups of hUCBMSCs; immunofluorescence method was used to detect the expression of CD31 and vWF after hUCBMSCs differentiated into endothelial cells. Results （1） hUCBMSCs can successfully induce differentiation into bone cells， chondrocytes and adipocytes. （2） The optimal concentration of FA to promote the proliferation of hUCBMSCs is 2 mg/L. （3） Compared with the control group， the ability of hUCBMSCs in the experimental group to proliferate， form tubes and secrete SCF was significantly enhanced， and the expression of CD31 and vWF increased significantly after FA induced tube differentiation （P<0.05）. Conclusion FA can promote the proliferation， the secretion of SCF from hUCBMSCs， and induce the differentiation of hUCBMSCs into tubes， further confirming that FA has the potential to promote angiogenesis.

〔Keywords〕 ferulic acid; mesenchymal stem cell; cell proliferation; stem cell factor; tube differentiation; angiogenesis

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一類具有自我復(fù)制、更新和多向分化潛能的多功能細(xì)胞，主要來源于中胚層，可在骨髓、外周血、臍血、脂肪組織中分離提取[1]。當(dāng)局部血管損傷時(shí)，MSCs能誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)分泌干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）調(diào)節(jié)體內(nèi)促血管新生細(xì)胞的增殖，使受損部位的血管以“發(fā)芽”的形式形成新的血管床，進(jìn)而促進(jìn)損傷血管的修復(fù)[2]。阿魏酸（ferulic acid， FA）屬酚酸類化合物，是中藥川芎、當(dāng)歸的主要成分之一，具有抑制血小板聚集、血管保護(hù)及抗氧化等作用[3-4]，研究[5]發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)血管新生、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本研究將探討FA對人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchy?

mal stem cells， hUCBMSCs）增殖、分泌SCF和成管分化的影響，為活血化瘀藥川芎、當(dāng)歸在臨床上的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 藥品與試劑

FA（批號：S31399，純度≥99.0%）、人淋巴細(xì)胞分離液（批號：P8610）均購自中國北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（批號：10270-106）、胰酶（批號：15050-057）均購自美國Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號：KGY002，中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）;PBS液（批號：SH30256.01B）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：SH30023.01B）均購自美國Hyclone公司;hUCBMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（批號：HUXUB-90021）、hUCBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（批號：HUXUB-90042）、hUCBMSCs成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（批號：HUXMA-90031）均購自美國OriCell公司;茜素紅染液（批號：130-22-3RT）、油紅O染液（批號：O1391-250ML）均購自美國Sigma公司;阿爾新藍(lán)染液（批號：MAS0981，中國MesGen公司）;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（批號：C0037，中國碧云天生物技術(shù)研究公司）;SCF-ELISA試劑盒（批號：KS14694，中國上海江萊生物科技有限公司）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（型號：XD-101，日本SANYO公司）;熒光顯微鏡（型號：BX51，日本OLYMPUS公司）;酶聯(lián)免疫檢測儀（型號：MK3，美國Thermo公司）;96孔板（型號：3590，美國Corning公司）;超凈工作臺（型號：SW-CJ-1FD，中國蘇州凈化公司）;臺式低速離心機(jī)（型號：5415R）、4 ℃離心機(jī)[型號：5804（R）]均購自德國Eppendorf公司;振蕩器（型號：WH-2，中國上海滬西分析儀器廠）。

2 方法

2.1? hUCBMSCs分離與培養(yǎng)

無菌條件下取足月健康新生兒臍帶血10 mL，加入20 U/mL肝素室溫靜置。將人淋巴細(xì)胞分離液移入離心管中，加入細(xì)胞懸液（將臍帶血與PBS液1﹕1稀釋混勻）經(jīng)密度梯度離心后得到單個(gè)核細(xì)胞，再移入含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，傳代到第3代凍存。

2.2? hUCBMSCs的誘導(dǎo)分化鑒定

將凍存細(xì)胞復(fù)蘇，當(dāng)細(xì)胞融合到80%左右時(shí)，胰酶消化，接種到明膠包被的24孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合到60%～70%時(shí)，分別按照hUCBMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、hUCBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、hUCBMSCs成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒說明書要求，將細(xì)胞移入相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)[成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基：含10%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)基;成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基：含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μg/L轉(zhuǎn)化生長因子β、50 g/L ITS（10 μg/L胰島素、5.5 μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.67 μg/L亞硒酸鈉）、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)基;成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤、200 μmol/L消炎痛的DMEM/F12培養(yǎng)基]，每3 d更換1次培養(yǎng)基，視細(xì)胞形態(tài)變化及生長情況，分別用茜素紅、阿爾新藍(lán)及油紅O染色以確定細(xì)胞成骨、成軟骨、成脂肪染色效果。在熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

2.3? FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度測定

將FA加入DMEM/F12培養(yǎng)基溶解至10 mL，反復(fù)吹打至充分溶解，0.22 μm濾過膜濾過，于

-20 ℃保存?zhèn)溆?。依?jù)CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒說明書要求，收集對數(shù)生長期的hUCBMSCs，離心收集后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。胰酶消化后在96孔板中配制100 μL細(xì)胞懸液，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，隨后加入FA至各DMEM/F12培養(yǎng)基中，分別稀釋至FA終濃度為0、1、2、4、8、16 mg/L，培養(yǎng)48 h后加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度（OD值）。同時(shí)設(shè)置對照孔，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。

2.4? 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

將hUCBMSCs隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度FA干預(yù)，對照組用等體積的PBS液處理。

2.5? CCK-8測定hUCBMSCs增殖能力

按“2.4”項(xiàng)分組培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h，收集各組細(xì)胞，依據(jù)CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒說明書要求，用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在450 nm處的OD值。

2.6? ELISA檢測hUCBMSCs分泌SCF能力

按“2.4”項(xiàng)分組培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h，收集各組上清液，參照ELISA試劑盒說明書，測定酶標(biāo)儀在450 nm的OD值。

2.7? Matrigel體外成管試驗(yàn)檢測hUCBMSCs成管能力

Matrigel基質(zhì)膠4 ℃過夜溶解，槍頭盒、EP管、96孔板均4 ℃過夜預(yù)冷，次日在冰盒上進(jìn)行鋪膠。當(dāng)各組細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁時(shí)，各組分別加入最適濃度FA及等容量PBS液，37 ℃孵箱孵育24 h，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。每孔隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)算小管形成長度，取平均值。

2.8? 免疫熒光法檢測hUCBMSCs內(nèi)皮分化能力

在培養(yǎng)板中放置載玻片，玻片上滴加2 mL含有1×106/mL的hUCBMSCs細(xì)胞懸液，加入FA對hUCBM?SCs干預(yù)48 h后取出并固定30 min，用PBS沖洗。滴加3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗。用0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min后PBS沖洗并吸干，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min;分別滴加1∶50稀釋的CD31抗體和1∶250稀釋的vWF抗體，濕盒4 ℃孵育過夜后，PBST 浸洗，滴加稀釋好的熒光二抗山羊抗小鼠IgG H&L（FITC），濕盒中20～37 ℃孵育1 h，PBST再浸洗;滴加DAPI避光孵育5 min，進(jìn)行核復(fù)染，PBST浸洗;去除液體，加50%甘油，然后熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，并采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以“x±s”表示，檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? hUCBMSCs的培養(yǎng)情況

光學(xué)顯微鏡下觀察第3代細(xì)胞，細(xì)胞邊緣清晰，形態(tài)均一，排列整齊，呈典型的長梭狀結(jié)構(gòu)，排列呈漩渦狀。見圖1。

3.2? hUCBMSCs的鑒定結(jié)果

取第4代hUCBMSCs向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化：經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4周，茜紅素染液染色后，可見鈣結(jié)節(jié)呈紅色為陽性，見圖2A，表明hUCBMSCs被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞。取第4代hUCBMSCs向成軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化：經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，阿爾新藍(lán)染色后，細(xì)胞呈藍(lán)色，見圖2B，表明hUCBMSCs被誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。取第4代hUCBMSCs向成脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化：經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，油紅O染液染色后可見空泡狀脂滴呈橘紅色，見圖2C，表明hUCBMSCs被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。

3.3? FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度測定結(jié)果

隨著FA處理濃度的增加，hUCBMSCs增殖能力逐漸增強(qiáng);當(dāng)FA濃度為2 mg/L時(shí)，細(xì)胞增殖能力最強(qiáng);隨后FA濃度繼續(xù)增加，hUCBMSCs的增殖能力逐漸減弱。因此，F(xiàn)A促hUCBMSCs增殖的最佳濃度為2 mg/L。見圖3。

3.4? FA對hUCBMSCs增殖能力的影響

對照組和實(shí)驗(yàn)組的OD值分別為（0.354±0.020）和（0.506±0.022），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

3.5? FA對hUCBMSCs分泌SCF的影響

對照組和實(shí)驗(yàn)組分泌SCF含量分別為（109.990±3.629） pg/mL和（367.747±36.948） pg/mL。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組分泌SCF含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

3.6? FA誘導(dǎo)hUCBMSCs體外成管情況

對照組和實(shí)驗(yàn)組hUCBMSCs體外形成管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的長度分別為（95.533±6.315） mm和（299.657±28.239） mm，實(shí)驗(yàn)組形成的血管長度明顯長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖6-7。

3.7? FA誘導(dǎo)hUCBMSCs向內(nèi)皮分化情況

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD31和vWF蛋白免疫熒光強(qiáng)度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖8-10。

4 討論

MSCs是一類具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，在特定誘導(dǎo)條件下可分化成神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，移植進(jìn)入機(jī)體可替換損傷組織或產(chǎn)生修復(fù)因子促進(jìn)組織再生[6-7]。因此，MSCs具有廣泛的應(yīng)用前景，極大地推動了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和退行性疾病的治療。目前，MSCs的獲得主要來源于骨髓、外周血、脂肪、臍血中[1]。研究[2，8-10]發(fā)現(xiàn)，MSCs旁分泌的SCF是C-Kit原癌基因編碼受體的配體蛋白，它參與機(jī)體發(fā)育中的多種細(xì)胞生長的調(diào)控，是一種多功能細(xì)胞生長因子，在MSCs增殖、分化和遷移過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Cao Z Y團(tuán)隊(duì)[11]研究發(fā)現(xiàn)，SCF可能通過表達(dá)與PI3K/AKT、ERK1/2和STAT3信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)用以維持線粒體功能，從而維持人骨髓MSCs活性。

四物湯是養(yǎng)血活血的基礎(chǔ)方劑，由熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍組成，當(dāng)歸具有補(bǔ)血養(yǎng)肝、活血調(diào)經(jīng)之效，川芎辛散溫通，能活血行氣止痛。FA作為兩藥的主要活性成分之一，其化學(xué)名是4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，現(xiàn)代藥理研究[4，12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A具有抗氧化、抗血栓、抗炎癥、抗血脂等作用。石定[13]發(fā)現(xiàn)FA能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并上調(diào)VEGF、PDGF及HIF-1α蛋白的表達(dá)，提高創(chuàng)面組織中微血管密度，促進(jìn)大鼠慢性創(chuàng)面愈合。李玉梅等[14]證實(shí)，黃芪甲苷聯(lián)合FA對氯化鈷所致的缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，有利于血管生成，其機(jī)制可能與激活JAK-STAT信號通路有關(guān)。以上研究均證實(shí)FA具有促進(jìn)血管新生、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的潛能。婁遠(yuǎn)蕾等[15]發(fā)現(xiàn)，MSCs經(jīng)阿魏酸鈉誘導(dǎo)后向神經(jīng)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能在腦缺血大鼠腦內(nèi)存活，且主要分布在缺血側(cè)損傷區(qū)，并仍保留已分化神經(jīng)細(xì)胞的特性。Qu Q X等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-126-3p修飾的hUCBMSCs移植對靜脈移植物具有更高的重新內(nèi)皮化。本研究是基于FA具有血管新生的作用和MSCs在特定條件下能定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)道，而將兩者聯(lián)系在一起展開的研究。

本研究探討了FA對hUCBMSCs增殖、分泌SCF和定向內(nèi)皮分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 mg/L FA為促進(jìn)hUCBMSCs增殖的最佳濃度，且對hUCBMSCs具有保護(hù)作用。隨著FA濃度的不斷增加，hUCBMSCs增殖能力較正常狀態(tài)下降，考慮高濃度的FA可能對hUCBMSCs具有毒性。對照組和實(shí)驗(yàn)組分泌SCF含量分別為（109.990±3.629） pg/mL和（367.747±36.948） pg/mL，結(jié)果表明，與對照組相比，2 mg/L FA能顯著促進(jìn)MSCs增殖及分泌SCF（P<0.05），誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化，促使其體外成管（P<0.05）。其機(jī)制可能是FA促進(jìn)MSCs增殖及分泌大量SCF，SCF作為一種多功能細(xì)胞生長因子又能自分泌調(diào)控MSCs，促進(jìn)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)新的血管床形成，這與石定[13]的研究結(jié)果相符合。然其具體作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，尚存在一定缺陷，F(xiàn)A介導(dǎo)hUCBMSCs發(fā)揮血管新生的具體作用機(jī)制及FA在血管新生方面的臨床應(yīng)用價(jià)值，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步挖掘。

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