高效液相法測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中阿魏酸含量

周往

【摘要】 目的 建立高效液相法（HPLC）測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中阿魏酸含量的方法。方法 采用HPLC測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 μm；流動相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液。結(jié)果 阿魏酸在5.00～80.00 ?g/ml濃度范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系（r=0.9998）， 回收率為98.86%， RSD=1.13%。結(jié)論 采用HPLC測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中的阿魏酸含量具有簡便、準(zhǔn)確和靈敏的優(yōu)勢， 可用于對當(dāng)歸補(bǔ)血丸進(jìn)行質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸補(bǔ)血丸；高效液相法；阿魏酸

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.213

當(dāng)歸養(yǎng)血丸主要是由當(dāng)歸、黃芪、白芍與地黃等10味中藥組成， 具有養(yǎng)血、益氣與調(diào)經(jīng)等功效， 臨床上多用于治療月經(jīng)不調(diào)、氣血兩虛等疾病， 并且可獲得滿意的療效。2005年版《中國藥典》法定標(biāo)準(zhǔn)鐘僅對當(dāng)歸顯微鑒別項目、丹皮薄層鑒別方法進(jìn)行了收錄， 這對藥品的生產(chǎn)與使用質(zhì)量造成一定的限制[1]。基于此， 本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)， 對高效液相法測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中阿魏酸含量方法的建立進(jìn)行了研究， 借以更好的控制藥物的質(zhì)量。

1 儀器與試劑

1. 1 儀器 高效液相色譜儀， 型號為Thermo fisher U3000， 以及配套工作站（包括紫外與熒光檢測器等）；生產(chǎn)廠家：Thermo fisher；C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；電子分析天平， 精密度為0.0001；紫外可見分光光度計， 型號為TU-1900。

1. 2 試劑 甲醇， 水為超純水， 其他試劑均為分析純。阿魏酸對照品生產(chǎn)批號為20131015， 生產(chǎn)廠家：中國藥品生物制品檢定所；當(dāng)歸養(yǎng)血丸源于市場銷售同一生產(chǎn)廠家， 生產(chǎn)批號為140306、140501、140701、140901、141101。

2 方法與結(jié)果

2. 1 色譜條件選擇 采用HPLC高效液相色譜法對當(dāng)歸補(bǔ)血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；流動相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例為25：75；檢測波長為：320 mm；柱溫：25℃；流速1.0 ml/min。；進(jìn)樣量10.0 μl。將阿魏酸峰值計算>3000作為理論塔板數(shù)。

2. 2 對照品溶液配制 精確稱取0.10 mg阿魏酸對照品， 將其置入5 ml的容量瓶中， 然后加入甲醇溶液定容， 靜置并作為備用。

2. 3 試驗樣品配制 采用電子天平準(zhǔn)確稱取當(dāng)歸養(yǎng)血丸10.0 g， 然后加入精確稱取的硅藻土10 g， 混勻后研細(xì)， 并將其置于提取器， 加入200 ml 70%甲醇溶液后提取， 提取時間為5 h， 將提取液壓縮到4 ml左右， 將殘渣采用流動相進(jìn)行溶解并轉(zhuǎn)移（20 ml容量瓶）， 并加入流動相進(jìn)行定容以備用。

2. 4 陰性樣品配制 采用電子天平精確稱取當(dāng)歸樣品10.0 g， 然后根據(jù)“2.3試驗樣品配制”方法進(jìn)行陰性樣品的配制。獲得的儲備液置于棕色容量瓶中。

2. 5 干擾試驗 取阿魏酸對照品溶液、試驗樣品溶液與陰性樣品溶液10 μl， 注入液相色譜儀后進(jìn)行檢測， 獲得圖譜， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對照品對本次試驗檢測并無影響。

2. 6 線性關(guān)系分析 精密吸取20 μg/ml濃度的阿魏酸對照品溶液置入2 ml容量瓶， 吸取體積分別為10、20、40、80、160和320 μl， 然后加入流動相定容， 分別吸取10 μl各濃度上述配制溶液注入到高效液相色譜儀中， 分別記錄各自峰面積， 縱坐標(biāo)表示峰面積， 橫坐標(biāo)表示進(jìn)樣量， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=3.8642×104x+0.0538×104。結(jié)果顯示， 阿魏酸5.00～80.00 μg/ml濃度范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系（r=0.9998）。

2. 7 精密度分析 吸取10 μl試驗樣品溶液（來源于同一試樣）， 重復(fù)5次進(jìn)樣， 測定其峰面積平均值， 測得RSD=1.13%。結(jié)果表明， 該方法具有良好的精密度。

2. 8 穩(wěn)定性分析 吸取10 μl試驗樣品溶液（來源于同一試樣）， 分別于0、2、4、8、16、20、24 h進(jìn)樣1次， 結(jié)果其RSD=0.94%， 表明阿魏酸24 h內(nèi)是基本穩(wěn)定的。

2. 9 重復(fù)性分析 取5份同一批號的樣品， 根據(jù)“2.3試驗樣品配制”方法制備樣品并對其阿魏酸含量進(jìn)行測定， 參照線性結(jié)果， 樣品中阿魏酸平均值為0.052 mg/g， RSD=1.54%， 具有良好的重復(fù)性。

2. 10 回收率分析 稱取2.0 g左右同一批號（140901）已知阿魏酸含量樣品， 共稱取5份， 然后精密稱定， 并加入2.4 ml 0.05 mg/g阿魏酸對照溶液， 測定其回收率。結(jié)果測得， 樣品1～5號阿魏酸實測含量見表1， 阿魏酸回收率平均為98.86%， RSD=1.13%。

2. 21 樣品含量測定 取5個批號當(dāng)歸養(yǎng)血丸試驗樣品， 制成待測溶液， 精密吸取10.0 μl供試樣品溶液與對照品溶液， 注入到高效液相色譜儀中進(jìn)行阿魏酸含量測定， 結(jié)果顯示， 阿魏酸色譜峰與樣品雜質(zhì)峰可實現(xiàn)基線分離， 理論塔板數(shù)>3000。5批試樣阿魏酸（140306、140501、140701、140901、141101）含量依次為：0.055、0.056、0.051、0.048、0.050 mg/g。

3 討論

阿魏酸是當(dāng)歸養(yǎng)血丸中的一個主要成分， 穩(wěn)定性不高， 在見光下容易發(fā)生分解， 因此阿魏酸對照品放置4 h后含量會出現(xiàn)下降， 因此在本次研究中采取了避光處理， 并在配制后及時使用[2]。制劑中阿魏酸含量在24 h內(nèi)的變化并不明顯， 比較穩(wěn)定[3]。

大量參考文獻(xiàn)關(guān)于流動相選擇主要考察了不同比例甲醇-0.1%磷酸溶液， 包括25：75、30：70、45：55， 但其分離效果并不佳， 樣品峰與雜質(zhì)峰圍著無法完全分離。本次研究中采用的流動相為甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例為25：75， 經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)用于測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量具有良好的分離效果。在波長的選擇中， 作者選擇了200～400 nm位置的掃描， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 檢測波長在320 nm時， 吸收峰最大， 干擾少， 因此將其作為本次檢測波長。2005年版《中國藥典》中當(dāng)歸項中阿魏酸含量限度為0.05%[3]， 測定5個批次當(dāng)歸養(yǎng)血丸中的阿魏酸含量， 其含量應(yīng)>0.035 mg/g。

綜上所述， 本文中建立的高效液相色譜法測定當(dāng)歸補(bǔ)血丸中的阿魏酸含量具有簡便、準(zhǔn)確和靈敏的優(yōu)勢， 測定方法穩(wěn)定， 通過對樣品數(shù)據(jù)的反復(fù)考察， 該方法專屬性強(qiáng)， 可用于對當(dāng)歸補(bǔ)血丸進(jìn)行質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2005：89.

[2] 何玲玲. 高效液相色譜法測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2011， 8（3）：60-62.

[3] 付麗佳. 當(dāng)歸補(bǔ)血丸中阿魏酸溶出度測定. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013， 19（5）：144-146.

[收稿日期：2016-04-25]

【關(guān)鍵詞】 巨大兒；因素；研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.212

巨大兒是產(chǎn)科常見的胎兒并發(fā)癥之一， 是難產(chǎn)、新生兒產(chǎn)傷的高危因素。國內(nèi)發(fā)生率約為7%， 國外發(fā)生率約為15.1%， 近年來有逐漸增加趨勢[1]。多年來臨床上采用各種方法力求提高胎兒出生體重估計的準(zhǔn)確性， 但對胎兒出生體重的估計仍存在較大誤差[2]。因此， 對巨大兒的致病機(jī)理進(jìn)行分析， 進(jìn)而對圍產(chǎn)期的相關(guān)病理狀況進(jìn)行評估， 及時提出恰當(dāng)?shù)念A(yù)防治療方案。

1 巨大兒對母兒的影響

胎兒過大， 子宮壁張力增加， 收縮乏力， 腹部過度膨隆， 腹肌收縮無力， 給陰道分娩造成困難。肩難產(chǎn)處理不當(dāng)， 可發(fā)生嚴(yán)重的軟產(chǎn)道損傷， 嚴(yán)重者還會出現(xiàn)子宮破裂的問題。目前分娩的過程中還有可能出現(xiàn)盆底組織的裂傷， 繼而導(dǎo)致子宮脫垂和陰道壁膨出現(xiàn)象， 還可引發(fā)尿瘺、糞瘺。巨大兒在分娩過程中， 容易造成新生兒窒息、部分巨大兒可能會終身肥胖， 同時巨大兒手術(shù)產(chǎn)率較正常胎兒明顯增高[3]。

2 發(fā)生巨大兒的危險因素

2. 1 妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM）也即母體在妊娠期間存在的糖尿病癥狀， 包含了一部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被診斷的患者。1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）將GDM列為糖尿病的一個獨(dú)立類型。GDM的發(fā)病機(jī)制尚不明確， 目前認(rèn)為胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗可能是GDM的重要發(fā)病機(jī)制。隨著孕婦體內(nèi)血糖的增高， 過多的血糖可經(jīng)由胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)， 但是由于能夠產(chǎn)生降血糖作用的胰島素并不能通過胎盤血液屏障， 故而胎兒體內(nèi)血液的血糖會較長時間處在過高情況， 這種情況會刺激胎兒自身胰腺激活， 分泌胰島素， 進(jìn)而增強(qiáng)胎兒的新陳代謝以及蛋白、脂肪等的合成， 進(jìn)而可能導(dǎo)致巨大兒出現(xiàn)[4]。由于胎兒自身分泌的胰島素能夠促進(jìn)其生長發(fā)育， 故而一旦孕婦出現(xiàn)妊娠期糖尿病， 特別是在妊娠的中后期， 一旦胎兒胰島素的含量過高， 體內(nèi)脂肪合成加速同時分解抑制， 相比于正常胎兒脂肪含量高出五成以上[5]。因此， 有效控制孕前體重， 孕期合理營養(yǎng)， 避免GDM發(fā)生以及對GDM孕婦進(jìn)行膳食指導(dǎo)， 監(jiān)測血糖， 是降低巨大兒發(fā)生的有效措施。

2. 2 營養(yǎng)因素 隨著近年對孕婦營養(yǎng)狀況的深入研究， 發(fā)現(xiàn)新生兒出生體重主要與孕婦的基礎(chǔ)營養(yǎng)和孕期營養(yǎng)攝入有關(guān)， 其中孕婦的基礎(chǔ)營養(yǎng)反映了孕前的營養(yǎng)狀況。研究顯示， 如果體內(nèi)存在較之于常值過高的脂肪， 勢必會對機(jī)體帶來大量負(fù)面因素。相關(guān)學(xué)者[6]以1814例孕婦的孕前體質(zhì)量指數(shù)（BMI）作為肥胖和正常體質(zhì)量的篩選指標(biāo)， 發(fā)現(xiàn)孕前肥胖組巨大兒的發(fā)生率為33.86%， 明顯高于正常體質(zhì)量組的2.0%（P<0.05）。崔寶奎[7]對3231例病例進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)孕婦在妊娠期間體重過重， 很容易導(dǎo)致新生兒體重過重， 甚至出現(xiàn)巨大兒現(xiàn)象， 同時對于母體而言， 也有可能導(dǎo)致孕婦的妊娠期糖尿病、高血壓等癥狀， 極其不利于妊娠安全。

2. 3 遺傳因素 胎兒在孕婦體內(nèi)最初生長的階段其主要影響因素是遺傳因素， 這些遺傳因素通常通過對細(xì)胞和組織的生長的影響， 對胎兒初期生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。遺傳因素在影響胚胎發(fā)育的過程中， 胎兒的基因型有著非常大的影響力。其中性染色體攜帶的遺傳因素可能會影響胎兒的體重， 有數(shù)據(jù)顯示正常男嬰通常比女嬰的體重略高200 g左右。在脂肪堆積的肥胖過程中， 接近80%左右是遺傳基因?qū)е碌摹，F(xiàn)階段對肥胖的基因研究， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)600余個與之相關(guān)的基因位點(diǎn)， 不同基因位點(diǎn)之間的協(xié)同作用進(jìn)而影響機(jī)體的新陳代謝， 多基因共同影響產(chǎn)生肥胖[8]。宋春梅等[9]做家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)巨大兒可能有家族遺傳傾向。

2. 4 產(chǎn)次 經(jīng)產(chǎn)婦相比于未生產(chǎn)過的產(chǎn)婦而言， 其自身機(jī)體腹壁及子宮壁相對更加松弛， 且環(huán)境對妊娠的關(guān)注度不足， 營養(yǎng)供給失度， 身體重量進(jìn)而大幅度上升， 與此同時也極有可能使得胎兒體重過高， 罹患巨大兒癥。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示， 產(chǎn)婦隨著妊娠次數(shù)的提高， 不同產(chǎn)次胎兒的重量呈明顯上升態(tài)勢。劉月紅等[10]將382例經(jīng)產(chǎn)婦與2099例初產(chǎn)婦比較， 經(jīng)產(chǎn)婦的巨大兒檢出率（10.93%）高于初產(chǎn)婦（6.38%）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。故而， 對產(chǎn)婦在妊娠期間的科學(xué)指導(dǎo)是防范巨大兒出現(xiàn)的有效措施。

2. 5 過期妊娠 過期妊娠即妊娠長于42周還沒有將胎兒分娩下， 如果過期妊娠胎盤形態(tài)功能基本正常者， 能維持胎兒在宮內(nèi)繼續(xù)生長， 則發(fā)展為巨大兒。在同時存在糖尿病、肥胖和過期妊娠的婦女中， 巨大兒的發(fā)生率在5%～15%[5]。閆華[11]對大量足月和過期妊娠孕婦進(jìn)行相關(guān)研究， 結(jié)果顯示過期妊娠中巨大兒出現(xiàn)病例高達(dá)6.04%， 相比于足月妊娠的0.68%而言， 顯然其存在更高的巨大兒危險隱患。

2. 6 妊娠期高血壓疾病 孕婦孕前和孕期體質(zhì)量增長過多， 可使脂肪組織明顯增加， 導(dǎo)致孕婦及胎兒內(nèi)分泌失調(diào)， 孕婦脂肪增加可引起體內(nèi)活性雌激素水平升高， 通過醛固酮分泌， 經(jīng)腎素-血管緊張素系統(tǒng)或通過增加腎小球重吸收， 引起鈉潴留， 導(dǎo)致妊娠高血壓疾病的發(fā)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)高血壓疾病是巨大兒發(fā)生的獨(dú)立危險因素。另一方面， 妊娠期高血壓可能引發(fā)胎盤的灌流量減少， 進(jìn)而誘發(fā)急性動脈粥樣硬化， 胎盤功能下降， 可致胎兒生長受限。

3 胎兒出生體重的產(chǎn)前預(yù)測

隨著超聲技術(shù)在產(chǎn)科的廣泛應(yīng)用， 超聲檢查已經(jīng)成為監(jiān)測胎兒生長發(fā)育、預(yù)測胎兒出生體重的重要手段。目前臨床上預(yù)測胎兒體重方法多是采用統(tǒng)計學(xué)、多參數(shù)計算胎重。有學(xué)者指出在對妊娠后期的胎兒身體指標(biāo)進(jìn)行評價的過程中， 可以使用其腹圍進(jìn)行評價， 如果該值高于36 cm， 那么此次妊娠過程的胎兒罹患巨大兒的可能性將急劇增高[13]。另有學(xué)者提出使用B超并不一定能夠起到非常精準(zhǔn)的效果， 結(jié)合B超和腹圍對妊娠期孕婦進(jìn)行檢查， 有利于對巨大兒身體指數(shù)進(jìn)行科學(xué)有效快速的判斷[14]。清楚孕婦及胎兒的生理狀況， 對于孕婦順利生產(chǎn)而言具有至關(guān)重要的作用， 同時對于產(chǎn)婦產(chǎn)前、中、后期及新生兒健康狀況的預(yù)測提供更加可行的方案。