雜交蘭葉藝品系主要生理特性的比較

林榕燕 吳建設(shè) 林兵 葉秀仙 鐘淮欽

摘要：為探明葉色變異對雜交蘭葉片主要生理特性的影響，對雜交蘭紫妍氏及其3個葉藝品系葉片的可溶性糖含量、丙二醛（MDA）含量、相對電導率、抗氧化酶活性及三磷酸腺苷酶（ATP）活性等進行比較分析。結(jié)果表明，相較于對照組（K21綠色葉片、K21-1和K21-2綠色區(qū)葉片），3個葉藝品系葉藝區(qū)葉片中ATP活性均有所下降，而超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和相對電導率、丙二醛含量均有所提升。此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，相對電導率、SOD活性和CAT活性與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量存在顯著或極顯著負相關(guān)關(guān)系;而POD活性、MDA含量、ATP活性、可溶性糖含量與葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量不存在顯著相關(guān)關(guān)系。由此推測葉色變異對相對電導率和抗氧化酶活性影響較大，抗氧化酶活性的提高有利于清除代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，防止膜脂過氧化加劇，對維持植物的正常生理代謝具有積極的作用。本研究結(jié)果為進一步開展雜交蘭葉藝形成機制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雜交蘭;丙二醛含量;相對電導率;抗氧化酶;相關(guān)性分析;葉藝性狀

中圖分類號： S682.310.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0136-05

葉色突變是自然界中一種比較常見的突變性狀，當葉綠素的合成與降解途徑出現(xiàn)異常，或是葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，都可能導致葉色突變體的產(chǎn)生[1]。截至目前，人們已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[2]、玉米（Zea mays）[3]、水稻（Oryza sativa）[4] 和黃瓜（Cucumis sativus）[5]等多種作物中獲得了葉色突變體。葉色突變體的應用范圍較廣，不僅可以作為研究光合作用、葉綠素代謝和葉綠體遺傳發(fā)育等方面的特殊材料，還可以作為優(yōu)良的種質(zhì)資源[6-8]?，F(xiàn)階段，雖然已有葉色突變體生理特性方面的研究，但不同的突變體研究結(jié)果不盡相同[9-10]。而且相對于模式植物和大田作物，有關(guān)蘭科植物葉色突變體的研究較少，突變機制仍不清晰。

筆者所在課題組于2008年在雜交蘭品種紫妍氏組培快繁過程中獲得1條黃化條紋根狀莖，經(jīng)變異根狀莖增殖和篩選、試管苗篩選、葉藝性狀穩(wěn)定性觀測等，選育出3個穩(wěn)定的雜交蘭葉色變異品系福韻西施、爪藝紫妍氏和中透紫妍氏[11]。新品系的選育為深入解析葉藝雜交蘭葉色變異的機制提供了理想材料。筆者所在課題組前期已對雜交蘭品種紫妍氏（K21）及其3個葉色變異品系（K21-1、K21-2、K21-3）的光合色素、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)等進行比較分析，相較于對照（K21綠色葉片），3個葉藝品系葉藝區(qū)葉片中的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量均顯著降低，葉綠體數(shù)量明顯減少，且不具備正常葉綠體的結(jié)構(gòu)特征，推測葉藝品系中葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能都已受到影響。但有關(guān)葉色變異對雜交蘭葉片中可溶性物質(zhì)、丙二醛（MDA）含量等生理特性的影響還未見相關(guān)報道。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以K21、K21-1、K21-2、K21-3為材料，研究不同葉藝品系葉片中相對電導率、可溶性糖含量、MDA含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）及三磷酸腺苷酶（ATP）活性的差異，為揭示雜交蘭葉色變異的生理機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所花卉研究中心種質(zhì)資源圃保存的長勢基本一致且生長狀況良好的雜交蘭紫妍氏（K21，葉片綠色）、福韻西施（K21-1，葉片邊緣具黃色條紋）、爪藝紫妍氏（K21-2，葉片邊緣具銀色條紋）和中透紫妍氏（K21-3，葉片中間具黃白色寬條紋，尖端綠色）4個栽培品系為試驗材料。試驗于2020年7月在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉生理實驗室進行。

用編號和字母表示各品系葉片取樣測定部位，即紫妍氏綠色葉片為K21（G）;福韻西施綠色區(qū)域葉片為K21-1（G），葉藝區(qū)域葉片為K21-1（Y）;爪藝紫妍氏綠色區(qū)域葉片為K21-2（G），葉藝區(qū)域葉片為K21-2（Y）;中透紫妍氏葉藝區(qū)域葉片為K21-3（Y）。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 相對電導率測定 稱取樣品后，用去離子水洗凈，吸干水分，剪成小段放入小燒杯中，加入去離子水20 mL，置于25 ℃條件下保存1 h，取出后采用電導儀測量電導率（E1）;再放入100 ℃ 沸水浴中20 min，取出，冷卻至室溫后測量煮沸后的電導率（E2）。用相對電導率（REC）來反映細胞膜的透性，計算公式為REC=（E1/E2）×100%。

1.2.2 可溶性糖含量、MDA含量測定 可溶性糖含量的測定參照植物可溶性糖含量檢測試劑盒說明書（Solarbio），采用蒽酮比色法，在620 nm處測定吸光度;MDA含量測定參照MDA含量檢測試劑盒說明書（Solarbio），采用硫代巴比妥酸（TBA）法，利用532 nm與450、600 nm下的吸光度差值按公式計算MDA的含量。

1.2.3 SOD、POD、CAT及ATP活性測定 ?SOD、POD、CAT及ATP活性的測定均參照相應的酶活性檢測試劑盒說明書進行，SOD活性的測定采用氮藍四唑法;POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法;CAT活性的測定采用可見光法;ATP活性通過測酶促反應過程中無機磷的釋放量來測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Execl 2007和SPSS 20.0軟件對文中涉及的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、顯著性分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫妍氏及其葉藝品系可溶性糖含量的差異

由圖1可知，K21-1、K21-2葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量顯著高于K21-1、K21-2綠葉區(qū)葉片，K21-1葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量是K21-1綠葉區(qū)葉片中的2.13倍，K21-2葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量是K21-2綠葉區(qū)葉片中的1.53倍。而 K21-3葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量則顯著低于K21-1、K21-2、K21的供試葉片，K21-3葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量僅為K21綠色葉片中的45.03%。不同葉藝品系葉藝區(qū)葉片的可溶性糖含量高低順序為K21-1>K21-2>K21-3。

2.2 紫妍氏及其葉藝品系葉片MDA含量的差異

由圖2可知，K21-1、K21-2葉藝區(qū)葉片中的MDA含量均顯著高于其相應的綠色區(qū)葉片，K21-1葉藝區(qū)葉片的MDA含量為K21-1綠葉區(qū)葉片中的1.46倍，K21-2葉藝區(qū)葉片的MDA含量為 K21-2綠葉區(qū)葉片中的1.63倍，K21-3葉藝區(qū)葉片中的MDA含量為K21綠色葉片中的1.67倍。不同葉藝品系葉藝區(qū)葉片的MDA含量排序為 K21-2>K21-1>K21-3。

2.3 紫妍氏及其葉藝品系葉片相對電導率的差異

由圖3可知，K21-2和K21-3葉藝區(qū)葉片的相對電導率均顯著高于綠色區(qū)葉片，而K21-1葉藝區(qū)葉片的相對電導率與其相應的綠色區(qū)葉片間無顯著性差異，但顯著高于K21綠色葉片。其中K21-3葉藝區(qū)葉片的相對電導率是K21綠色葉片中的2.03倍。不同葉藝品系葉藝區(qū)葉片的相對電導率排序大小依次為K21-3>K21-2>K21-1。

2.4 紫妍氏及其葉藝品系葉片相關(guān)酶活性的差異

由圖4可以看出，K21-1、K21-2和K21-3葉藝區(qū)中SOD、POD、CAT活性均高于供試的綠色區(qū)葉片，其中K21-3葉藝區(qū)葉片的SOD和CAT活性分別是K21綠色葉片中的1.88倍和1.64倍，K21-1葉藝區(qū)葉片的POD活性為K21-1綠葉區(qū)葉片中的2.55倍。K21-1和K21-2葉藝區(qū)葉片中ATP活性低于其相應的綠色區(qū)葉片，比例分別為62.29%和67.19%，K21-3葉藝區(qū)葉片中的ATP活性顯著低于K21綠色葉片，僅為K21綠色葉片中的52.42%。

2.5 測定生理指標與葉綠素含量的相關(guān)性分析

將試驗所測生理指標與前期測定的葉綠素含量進行相關(guān)性分析。由表1可知，相對電導率和SOD活性與葉綠素a、總?cè)~綠素含量存在顯著負相關(guān)關(guān)系，與葉綠素b含量存在極顯著負相關(guān)關(guān)系（r=-0.928和r=-0.921）;CAT活性與葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量存在顯著負相關(guān)關(guān)系;MDA含量、POD活性與葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量存在負相關(guān)關(guān)系，但不顯著;可溶性糖含量與葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量相關(guān)性不大;ATP活性與葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量存在正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。

3 討論與結(jié)論

葉色突變體是研究植物光合作用、葉綠體發(fā)育、抗逆性機制及激素生理等的重要材料，同時也是創(chuàng)造優(yōu)異種質(zhì)資源的理想材料。張文慧等通過遺傳分析與基因定位研究，發(fā)現(xiàn)了1個新的控制水稻葉色突變表型的基因[12]。劉忠祥等對玉米黃綠葉突變體進行遺傳效應分析和基因初步定位，發(fā)現(xiàn)了控制該突變性狀的隱性核基因[13]。相較于模式植物，目前有關(guān)蘭花葉藝形成的研究報道還較少，許慶全等雖然通過比較光合色素含量、葉綠素熒光動力學參數(shù)、葉片結(jié)構(gòu)，解析了墨蘭、文心蘭、春劍、建蘭等葉藝形成的生理機制，但關(guān)于葉藝性狀形成的機制仍然不清楚[14-18]。

筆者所在課題組前期選育出3個穩(wěn)定的雜交蘭葉色變異品系，同時通過研究推測這3個葉藝品系葉色變異的原因與葉綠素缺乏有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過分析葉藝品系葉片中的一些主要生理特性與親本的差異，并探討了這些生理指標與葉綠素含量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)葉色變異對葉片的MDA含量、ATP活性、抗氧化酶活性和相對電導率均有較大影響，其中相對電導率、SOD活性和CAT活性與葉綠素含量之間存在顯著或極顯著負相關(guān)關(guān)系。

植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT是重要的抗氧化酶，SOD通過催化超氧化物自由基發(fā)生歧化反應，從而清除超氧自由基;POD和CAT通過清除H2O2、羥自由基等過氧化物，維持體內(nèi)活性氧代謝平衡[19-20]。因此，SOD、POD、CAT活性常被作為衡量植物抗逆性及抗氧化能力的指標。如蒲公英葉片中的SOD、POD和CAT活性在海水復合鹽脅迫下增加[21];鋁脅迫條件下，水稻根尖SOD、POD和CAT活性比對照組分別增加1.39、1.42和1.56倍[22];泡桐黃化突變體的SOD、POD和CAT活性均高于其他種[23]。本研究測定發(fā)現(xiàn)K21-1、K21-2和 K21-3葉片中的SOD、POD、CAT活性均高于相應的對照組，說明葉色變異可能導致葉片中產(chǎn)生大量的活性氧，從而激發(fā)葉藝品系葉片酶保護系統(tǒng)，通過提高抗氧化酶活性來調(diào)控活性氧平衡，以維持植物的正常生理代謝。

當植物受到逆境脅迫時，細胞內(nèi)活性氧代謝平衡被破壞，活性氧的大量積累會引起膜脂過氧化，其產(chǎn)物MDA含量增加，細胞膜透性增加，電解質(zhì)滲透加大，相對電導率升高[24-26]。因此MDA含量和相對電導率常被作為表征細胞膜受損程度及其透性的指標，反映對逆境反應的強弱。在紫花苜蓿堿脅迫[27]、春大豆葉片干旱脅迫[28]、泡桐黃化突變體[23]等研究中，均有MDA含量、相對電導率等指標的測定。本研究中3個葉藝品系葉片中MDA含量和相對電導率較對照組高，與中國蘭葉色突變體葉藝隆昌素丙二醛含量及相對電導率較其親本隆昌素升高的研究結(jié)果[29]一致，說明葉色變異導致葉藝品系葉片中細胞膜損傷程度增大，推測其可能是由于葉綠素缺乏引發(fā)的光脅迫導致電解質(zhì)外滲，細胞膜透性增強。

綜上，雜交蘭3個葉藝品系的SOD、POD、CAT活性與MDA含量、相對電導率較對照組升高，且與葉綠素含量之間存在負相關(guān)關(guān)系，推測葉藝品系葉片中抗氧化酶活性的提高有利于清除代謝產(chǎn)生的活性氧和自由基，能防止膜脂過氧化加劇，減少但又不能完全消除葉色變異帶來的生理代謝方面的不良影響，對維持植物的正常生理代謝具有積極的作用。葉色突變體作為一種特殊的研究材料，現(xiàn)已在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐中被廣泛利用，筆者所在課題組下一步將對該雜交蘭葉藝品系進行基因精細定位及蛋白組轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，旨在為雜交蘭優(yōu)良品系的定向選育提供理論基礎(chǔ)。

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