米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇檢測方法的研究

陳麗娥 董曉尉 徐廣偉 郭躍平

摘 要：建立了氣相色譜外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法檢測米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇的含量，并對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較。外標(biāo)法中，樣品經(jīng)甲苯30 ℃超聲提取，采用HP-5色譜柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm）分離，用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定含量;內(nèi)標(biāo)法中，樣品經(jīng)甲苯提取后，加入一定濃度的鄰苯二甲酸二葵酯作為內(nèi)標(biāo)物，用標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法測定。結(jié)果表明，在0.01～0.20 mg/mL

范圍內(nèi)，兩種方法中2種目標(biāo)化合物都呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.99，檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.07%、0.08%和0.20%、0.25%;3個(gè)加標(biāo)水平下，米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的平均加標(biāo)回收率為95.8%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.769%～3.240%（n=6）。兩種方法簡單、高效、準(zhǔn)確，可為米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

關(guān)鍵詞：氣相色譜法;二十八烷醇;三十烷醇;高級(jí)脂肪烷醇;米糠脂肪烷醇

米糠脂肪烷醇是2017年衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的一種新食品原料。有研究表明，米糠脂肪烷醇對(duì)于在改善身體狀態(tài)以及保健等多方面具有良好的功效，目前已被應(yīng)用于各種功能性食品[1]或保健食品中。

米糠脂肪烷醇主要來源于米糠，是以米糠為原料制得米糠蠟，經(jīng)皂化、提取、過濾等工藝制成的十二個(gè)碳原子以上蠟狀固體的飽和一元醇[2]。其性狀為白色到淺黃色粉末，無味，對(duì)光、熱穩(wěn)定，主要成分為二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇。一般以二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇含量之和計(jì)。

目前國內(nèi)外研究證實(shí)，二十八烷醇是一種天然的抗疲勞物質(zhì)，在增強(qiáng)耐力、精力和體力[3-4];調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能[5-6];

增強(qiáng)登高運(yùn)動(dòng)機(jī)能[7-8];保護(hù)肝臟作用[9-10];改善新陳代謝比率[11-13]，降低膽固醇[14]、血脂[15-16]，抗凝血[17]等方面有著明顯的作用。而三十烷醇作為新型的天然植物生長劑，證實(shí)不僅對(duì)植物生長具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用，還具有明顯的增產(chǎn)效果[18-20]?，F(xiàn)國內(nèi)已有多家利用米糠蠟制備二十八烷醇和三十烷醇的企業(yè)，但目前還沒有相對(duì)應(yīng)的國家檢測標(biāo)準(zhǔn)，這導(dǎo)致企業(yè)無法向購買者提供檢定證書，影響銷售，同時(shí)也造成監(jiān)管方面存在缺口。

本文采用火焰離子化檢測器檢測，建立了米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇的氣相色譜外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)兩種檢測方法，旨在為國家制定米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇含量測定和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、評(píng)估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

7890A氣相色譜儀，配火焰離子化檢測器（FID）（美國Agilent公司）;2500TH數(shù)控超聲波清洗器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。二十八烷醇（純度97.4%，BePure）;三十烷醇（純度98.5%，BePure）;鄰苯二甲酸二葵酯（純度95%，阿拉?。?甲苯（HPLC級(jí)，德國CNW科技公司）;準(zhǔn)確稱取20 mg二十八烷醇和三十烷醇標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.01 mg）

于100 mL容量瓶中，用甲苯配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL

的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，常溫密封保存，備用;確稱取50 mg鄰苯二甲酸二葵酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲苯配制成5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，冷藏保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

外標(biāo)法：稱取20 mg米糠脂肪烷醇樣品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超聲提取5 min，使其完全溶解，靜置至室溫后用甲苯定容至100 mL，濾液供氣相色譜儀測定。

內(nèi)標(biāo)法：稱取20 mg米糠脂肪烷醇樣品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超聲提取5 min，使其完全溶解，靜置至室溫后用甲苯定容至100 mL，取1 mL濾液，加入40 μL內(nèi)標(biāo)液，混勻，供氣相色譜儀測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：HP-5柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）;進(jìn)樣口溫度：300 ℃;檢測器（FID）溫度：320 ℃;程序升溫：初始溫度為200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量：2 μL;載氣：高純氮?dú)猓兌葹?9.999%）;恒定流速：1 mL/min。二十八烷醇的保留時(shí)間為13.426 min，三十烷醇的保留時(shí)間為15.722 min。二十八烷醇和三十烷醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

1.3 計(jì)算方法

兩種方法都直接采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方式進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的探討

紅外光譜可以表征羥基（-OH）、末端甲基（-CH3）、次甲基（-CH2）以及（-CH2-）n特有的吸收峰，證明含有飽和碳直鏈的伯醇，但二十八烷醇和三十烷醇是同系物，都有類似的吸收峰，故還需要結(jié)合質(zhì)譜分析，測其分子離子峰，以及主要特征碎片，證明有沒有側(cè)鏈，確定其分子量。而二十八烷醇和三十烷醇在紫外光譜中，特征吸收波長分別在198 nm和200 nm處[21]，非常接近，因而采用紫外檢測器對(duì)其定量不可行。由于二十八烷醇和三十烷醇的熱穩(wěn)定性好，因此采用氣相色譜法分析會(huì)是最經(jīng)濟(jì)簡便、有效可靠的方法。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的選擇對(duì)樣品的分離十分重要，通常不同類型的填料對(duì)同一樣品有不同的保留效果。HP-5色譜柱是高性能通用色譜柱，其應(yīng)用范圍廣，溫度上限高。根據(jù)二十八烷醇和三十烷醇的弱極性，以及柱子對(duì)高溫的耐受性，采用HP-5色譜柱時(shí)，二十八烷醇和三十烷醇能較好的保留和分離，且響應(yīng)值高。

2.2.2 儀器條件的選擇

二十八烷醇和三十烷醇屬于同系物，在氣相色譜分析中，對(duì)于組分沸點(diǎn)范圍窄、化學(xué)性質(zhì)類似的樣品，一般選用一價(jià)升溫。另外二十八烷醇和三十烷醇都屬于高沸點(diǎn)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在初始溫度為200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min時(shí)，兩者可以得到很好的分離。

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取試劑的篩選

米糠脂肪烷醇不溶于水，對(duì)酸、堿、還原劑穩(wěn)定，但能溶于熱乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、環(huán)己烷、正己烷、異丙醇、石油醚（60-90）、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。本文重點(diǎn)比較了10種有機(jī)試劑對(duì)于米糠脂肪烷醇的溶解情況，以及從峰面積比較其提取效果。不同提取溶劑對(duì)米糠脂肪烷醇的溶解情況見表1，提取效果見圖2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇、甲醇和丙酮作為溶劑時(shí)，米糠脂肪烷醇的溶解效果最差，響應(yīng)值最低;環(huán)己烷、正己烷、異丙醇和石油醚（60-90）作為溶劑時(shí)，響應(yīng)值高，但對(duì)于米糠脂肪烷醇的溶解度低，對(duì)溫度要求高，溶解后更容易析出;三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷作為溶劑時(shí)，米糠脂肪烷醇的溶解速度快，雖然三氯甲烷作為溶劑溶解效果最好，但響應(yīng)值偏低，二氯甲烷的響應(yīng)值更低，而甲苯作為溶劑時(shí)溶解度比三氯甲烷低，但響應(yīng)值高。另外根據(jù)《中華人民共和國藥典2005版》中溶劑毒性分類，三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷都屬于二類溶劑，但從每日允許接觸量看，毒性：三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯。從毒理學(xué)資料分析，三氯甲烷屬中等毒性，具有強(qiáng)麻醉性，而且在人體內(nèi)不能被肝臟代謝，毒性最大;甲苯和二氯甲烷差不多，屬低毒類，但甲苯很不活潑，在人體溫度下不與人體蛋白質(zhì)、酶、氨基酸等活性物質(zhì)反應(yīng)，大部分可在體內(nèi)被代謝;而二氯甲烷則不同，它是鹵代烴，很容易與人體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶、氨基酸等發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生致癌物質(zhì)。因此，最終確定提取溶劑為甲苯。

2.3.2 提取條件的優(yōu)化

考慮到米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量各不同，為確定含量對(duì)溶解效果的影響，采用甲苯對(duì)含量為10%、30%、50%、70%和90%的二十八烷醇和三十烷醇的米糠脂肪烷醇樣品進(jìn)行提取比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稱樣量相同的樣品中二十八烷醇和三十烷醇的含量多少對(duì)樣品的溶解速度影響不大。根據(jù)溫度對(duì)樣品的溶解速度的影響，溫度越高，溶解度越大，飽和度越高，為進(jìn)一步優(yōu)化提取效果，采用不同溫度、不同超聲時(shí)間對(duì)不同純度樣品進(jìn)行提取。研究發(fā)現(xiàn)，在水溫30 ℃超聲提取，甲苯對(duì)樣品的溶解速度比其在常溫20 ℃超聲提取快，30 ℃超聲提取5 min，樣品完全溶解，相當(dāng)于20 ℃超聲提取25 min;而30 ℃以上的超聲提取效果都差不多，考慮到超聲提取后要靜置至常溫再定容，所以水溫30 ℃超聲提取較為適宜。另外研究發(fā)現(xiàn)，樣品稱樣量越大，在低溫（2～8 ℃）靜置一段時(shí)間，溶解后的樣品晶體析出越多，特別是三十烷醇的含量越高，越容易析出，恢復(fù)至25 ℃一段時(shí)間后會(huì)復(fù)溶。因此，最終的提取條件定為稱取樣品0.02 g，水浴30 ℃超聲提取5 min。

2.4 線性方程、檢出限和定量限

外標(biāo)法：配制質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.20mg/mL的二十八烷醇和三十烷醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)行測定。以目標(biāo)組分峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)作線性回歸分析（見表2）。內(nèi)標(biāo)法：配制與外標(biāo)法同樣濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在1 mL系列濃度中分別加入40 μL鄰苯二甲酸二葵酯內(nèi)標(biāo)工作液，以目標(biāo)組分跟內(nèi)標(biāo)物的峰面積比y為縱坐標(biāo)，以系列濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)作線性回歸分析（見表2）。結(jié)果表明，兩種方法中2種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。根據(jù)1.2.2的色譜條件，將1.1中的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液逐步稀釋濃度，以3倍和10倍信噪比（S/N）為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），二十八烷醇和三十烷醇的檢出限分別為0.07%和0.08%，定量限分別為0.2%和0.25%（見表2）。

2.5 回收率和精密度

向樣品中分別加入基本等量、2倍等量和10倍等量3個(gè)水平的二十八烷醇和三十烷醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所建立的方法進(jìn)行測定。每份樣品進(jìn)行6次平行測定，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，兩種方法中二十八烷醇和三十烷醇的平均回收率為95.8%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.769%～3.24%，說明外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法都具有較好的可靠性。

3 結(jié)論

本文建立了高效的氣相色譜外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法檢測米糠脂肪烷醇中高級(jí)脂肪烷醇的含量。外標(biāo)法更簡便，但對(duì)儀器的要求高，內(nèi)標(biāo)法可減少儀器誤差，兩種方法都具有簡單高效，靈敏度高，分析速度快的特點(diǎn)?？蔀閲绎L(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持，為制定米糠脂肪烷醇的檢測標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

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