TM4SF1對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲轉移及EMT的影響

梁 冰，鄧 萌，裴新紅

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院乳腺外科 鄭州450014 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科 鄭州 450052

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性健康。癌癥統(tǒng)計數據[1-2]顯示，乳腺癌占女性新發(fā)腫瘤的30%，高居首位，且患者趨于年輕化。術后復發(fā)和轉移是乳腺癌死亡的主要原因，因此探討乳腺癌侵襲轉移的發(fā)生機制對改善患者預后具有重要意義。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞獲得遷移能力的方式之一[3]。研究[4]表明，EMT在乳腺癌、肺癌、食管癌、肝癌等多種惡性腫瘤的侵襲轉移中發(fā)揮重要作用。四次跨膜蛋白1(transmembrane-4-L-six-family-1，TM4SF1)，又稱腫瘤相關抗原L6，在正常組織中不表達或低表達，但在多種上皮性來源的癌組織(如乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等)中表達異常增高，并參與腫瘤細胞的黏附、侵襲、轉移等過程[5-8]。有報道[7]指出TM4SF1可通過調節(jié)EMT參與結直腸癌的侵襲轉移過程。本研究擬使用siRNA技術抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞中TM4SF1的表達，觀察細胞侵襲轉移能力及EMT相關因子表達的變化，從而分析TM4SF1在乳腺癌侵襲轉移及EMT中的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料MDA-MB-231細胞購自上海中科院，于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Invitrogen公司，BCA試劑盒、Lipofectamine 3000購自上海碧云天生物技術有限公司，Transwell小室、Matrigel膠購自BD公司，TM4SF1多克隆抗體、Vimentin多克隆抗體和N-cadherin單克隆抗體購自Invitrogen公司，CCK-8試劑盒、E-cadherin、α-SMA、β-catenin、β-actin單克隆抗體購自Abcam公司，Snail、Slug多克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司，ZEB、TWIST單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 TM4SF1 siRNA的設計合成上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成靶向TM4SF1的siRNA。TM4SF1 siRNA正義鏈：5’-UUGAAUAAGACACA AGAUGAA-3’,反義鏈：5’-CAUCUUGUGUCUUAUU CAAGU-3’。陰性對照siRNA正義鏈：5’-UUCAC CGAGCGUGUCGCGUTT-3’,反義鏈：5’-ACGUGC CACGUUCGGUGAATT-3’；陰性對照siRNA為通用無義序列，與人類基因無同源性。

1.3 TM4SF1 siRNA轉染及分組轉染前24 h，取對數生長期MDA-MB-231細胞接種于6孔板，每孔接種約2×105個細胞；轉染前4 h更換為不含抗生素及血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗共分3組：空白對照組不加任何處理，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，TM4SF1 siRNA組轉染TM4SF1 siRNA。參照Lipofectamine 3000說明書進行轉染，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 3組細胞中TM4SF1蛋白表達的檢測采用Western blot法。收集上述3組細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取總蛋白100 μg，水浴鍋變性10 min后上樣，經100 g/L SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，4 ℃封閉2 h，TBST清洗3次，每次10 min；加TM4SF1多克隆抗體(按1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育；TBST清洗3次，每次10 min；加二抗室溫下孵育2 h；ECL化學發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影。應用TotalLab 2.0軟件檢測條帶灰度值，以目的蛋白和內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.5 3組細胞增殖能力的檢測采用CCK-8實驗。取96孔板，分別接種3組細胞懸液(細胞密度為4×103個/mL)，100 μL/孔，每組設8個復孔。培養(yǎng)24、48、72 h后，向各孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.6 3組細胞侵襲轉移能力的檢測轉移實驗中Transwell小室上、下室之間由聚碳酸酯膜相隔，侵襲實驗上、下室之間由包被Matrigel膠的聚碳酸酯膜相隔。將3組MDA-MB-231細胞懸液(細胞密度為5×105個/mL)100 μL加入上室，下室加600 μL含體積分數20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。取出小室，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，甲醇固定30 min，室溫下風干；棉簽輕擦去上層細胞，1/1 000結晶紫染色20 min，PBS沖洗。挑選5個視野(×200)，記錄侵襲細胞數和遷移細胞數，取均值。實驗重復3次。

1.7 3組細胞中EMT相關蛋白、Snail、Slug、ZEB、TWIST蛋白表達的檢測提取3組細胞總蛋白后同1.4方法測定E-cadherin、Vimentin、α-SMA、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、ZEB、TWIST蛋白的表達。E-cadherin抗體按1∶50稀釋，N-cadherin、β-catenin、Slug、TWIST抗體按1∶500稀釋，Vimentin、α-SMA、Snail抗體按1∶1 000稀釋，ZEB抗體按1∶2 000稀釋。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學處理應用Graphpad Prism 8處理數據。采用單因素方差分析比較3組間以上觀察指標的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中TM4SF1蛋白表達水平的比較3組細胞中TM4SF1蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=30.780，P<0.001)。與空白對照組(0.69±0.04)和陰性對照組(0.68±0.02)相比，TM4SF1 siRNA組細胞中TM4SF1蛋白表達水平(0.36±0.04)降低(P<0.05)(圖1)。

1～3：分別為TM4SF1 siRNA 組、陰性對照組和空白對照組

2.2 3組細胞增殖、侵襲、轉移能力的比較與空白對照組和陰性對照組相比，轉染后培養(yǎng)48、72 h，TM4SF1 siRNA組細胞增殖能力下降，轉染后侵襲細胞數、遷移細胞數減小(表1)。

表1 3組細胞增殖、侵襲、轉移能力的比較

2.3 3組細胞中EMT相關蛋白表達水平的比較與空白對照組和陰性對照組相比，TM4SF1 siRNA組上皮表型E-cadherin蛋白表達水平升高，而間質表型Vimentin、α-SMA、N-cadherin蛋白表達水平降低；3組間β-catenin蛋白的表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義(圖2、表2)。

1～3：分別為TM4SF1 siRNA 組、陰性對照組和空白對照組

表2 3組細胞中EMT相關蛋白表達水平的比較

2.4 3組細胞中Snail、Slug、ZEB和TWIST蛋白表達水平的比較與陰性對照組和空白對照組相比，TM4SF1 siRNA組細胞中Snail和TWIST蛋白的表達水平下降(圖3、表3)。

1～3：分別為TM4SF1 siRNA 組、陰性對照組和空白對照組

表3 3組細胞中Snail、Slug、ZEB和TWIST蛋白表達水平的比較

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一。雖然乳腺癌手術、放化療、生物靶向治療等手段日益完善，但部分患者由于淋巴結或遠處轉移，預后不佳[1]。因此探討侵襲轉移發(fā)生機制、探尋相應干預措施對于改善乳腺癌預后具有重要意義。

四次跨膜蛋白是一類跨膜連接蛋白家族，其成員多在腫瘤細胞中高表達，并在腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移過程中擔負重要角色。TM4SF1是該家族成員之一，其在乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中表達異常增高[5-8]。研究[9]顯示TM4SF1高表達可通過誘導人臍靜脈內皮細胞毛細血管形成而促進腫瘤新生血管的形成。前列腺癌中，TM4SF1可作為雄激素受體的靶點調節(jié)激素功能反應，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[10]。有研究[11]表明TM4SF1在乳腺癌組織中表達增高，且其表達增高與乳腺癌淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。EMT是腫瘤細胞獲得遷移能力的有效方式之一，是腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移的第一步也是最重要的一步。EMT最主要的特征是上皮表型標志E-cadherin表達減少，間質表型Vimentin、α-SMA、N-cadherin、β-catenin等表達增加[3]。本研究結果顯示TM4SF1 siRNA 轉染48 h能抑制MDA-MB-231細胞中TM4SF1蛋白的表達，CCK-8實驗和Transwell侵襲轉移實驗表明細胞的增殖和侵襲轉移能力也下降，細胞中上皮表型E-cadherin蛋白表達增高，而間質表型Vimentin、α-SMA、N-cadherin的表達降低，但β-catenin的表達無明顯變化，上述結果表明TM4SF1在MDA-MB-231細胞中高表達，且抑制TM4SF1的表達可以抑制細胞的增殖、侵襲轉移能力和EMT。

EMT受到多種信號因子的調控，其中E-cadherin轉錄抑制因子Snail、Slug、ZEB和TWIST在EMT發(fā)生中起到重要作用[12-13]。本研究結果顯示轉染TM4SF1 siRNA的MDA-MB-231細胞中Snail和TWIST表達下降，而Slug和ZEB表達無明顯變化。推測TM4SF1有可能通過調控Snail和TWIST的表達參與乳腺癌MDA-MB-231細胞的EMT，進而影響其侵襲轉移過程。

綜上所述，TM4SF1與乳腺癌侵襲轉移發(fā)生密切相關，TM4SF1有可能通過調控EMT參與此過程。因此TM4SF1可能是一個有潛力的診斷和治療乳腺癌的靶點。