阿膠中牛皮源成分補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的改進(jìn)

魯 輝，閔春艷，黃逸文，錢 巖，邢以文

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104）

阿膠為馬科動(dòng)物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。阿膠作為藥品使用已有2500多年的歷史，《中國(guó)藥典》（2020年版）一部中明確規(guī)定阿膠應(yīng)以驢皮熬制[1]。近年，隨著阿膠需求的迅猛增加，其原料驢皮也愈加緊俏，價(jià)格連連攀升，這就造成了不少企業(yè)為了降低生產(chǎn)成本在生產(chǎn)阿膠時(shí)以牛、豬等的皮熬制的膠類冒充阿膠或以動(dòng)物骨、舊皮革等制成的偽品膠冒充阿膠[2-4]，此類行為極大損害了消費(fèi)者的利益并影響人民群眾的用藥安全。為了有效控制阿膠藥材的質(zhì)量，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2012年發(fā)布了“阿膠中牛皮源含量的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法”（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)2012001）[5]。此后，為了有效控制以阿膠為君藥的中成藥質(zhì)量，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局又于2018年發(fā)布了阿膠補(bǔ)血膏（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：BJY201804）[6]及阿膠補(bǔ)血口服液（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：BJY201805）[7]中牛皮源成分檢查項(xiàng)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。上述方法均以m/z641.3（雙電荷）→726.2和m/z641.3（雙電荷）→783.3提取的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜峰作為牛皮源成分的特征肽段峰，并規(guī)定樣品中不得同時(shí)檢出；若同時(shí)檢出，則要求樣品中m/z641.3（雙電荷）→726.2提取的MRM色譜峰面積不得超過對(duì)照溶液中相應(yīng)的峰面積。上述補(bǔ)充檢驗(yàn)方法結(jié)合《中國(guó)藥典》（2020年版）一部品種項(xiàng)下相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)作為日常監(jiān)管手段，較好地控制了阿膠原藥材及其中成藥的質(zhì)量。

上述補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的色譜分析時(shí)間均為40 min，不利于日常監(jiān)管快速分析。同時(shí)，阿膠原藥材（供試品稱樣量0.1 g）和阿膠補(bǔ)血膏及阿膠補(bǔ)血口服液等中成藥（供試品稱樣量相當(dāng)于阿膠原藥材0.1 g）牛皮源檢查分別采用濃度為0.3 μg/ml的牛皮特征肽A對(duì)照品溶液和100 μg/ml的黃明膠對(duì)照藥材溶液作為牛皮源成分的對(duì)照溶液。監(jiān)管中發(fā)現(xiàn)兩種不同的對(duì)照溶液其m/z641.3（雙電荷）→726.2和m/z641.3（雙電荷）→783.3提取的MRM色譜峰面積值差異較大，這會(huì)導(dǎo)致阿膠原藥材與阿膠類中成藥牛皮源成分檢查結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生差異。本文旨在進(jìn)一步優(yōu)化補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的色譜系統(tǒng)，考察并比較用于制備牛皮源成分參比溶液的牛皮特征肽A對(duì)照品與黃明膠對(duì)照藥材之間的差異，改進(jìn)阿膠中牛皮源成分補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，為更合理有效的監(jiān)管提供支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity 型超高效液相色譜儀-Xevo TQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；XS205 DU型電子天平（Mettler Toledo儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

胰蛋白酶（批號(hào)：140615-200206），牛皮特征肽A對(duì)照品（批號(hào)：111941-201804，含量93.8 %），阿膠對(duì)照藥材（批號(hào)：121274-201703），黃明膠對(duì)照藥材（批號(hào)：121695-201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（LC-MS級(jí)，賽默飛世爾）；碳酸氫銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 %甲酸溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，5 %A～11 %A；10～11 min，11 %A～80 %A；11～13 min，80 %A；13～13.01 min，80 %A～5 %A；13.01～15 min，5 %A；流速為0.3 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為5.0 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式，監(jiān)測(cè)模式：MRM，選擇牛皮特征多肽m/z641.3（雙電荷）→726.2和m/z641.3（雙電荷）→783.3作為檢測(cè)離子對(duì)，噴霧電壓3.5 kV，錐孔電壓30 V，脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣體流量1000 L/min。

2.3 溶液的制備

2.3.1 牛皮特征肽A對(duì)照品溶液的制備 取牛皮特征肽A對(duì)照品16 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加阿膠基質(zhì)溶液（取阿膠對(duì)照藥材粉末0.1 g，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液40 ml，超聲處理30 min，加1 %碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻（每1 ml含牛皮特征肽A 0.3 μg），取該溶液于10 000 r/min離心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml離心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.2 黃明膠對(duì)照藥材溶液的制備 稱取黃明膠對(duì)照藥材粉末0.1 g，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液40 ml，超聲處理30 min，加1 %碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5 ml，置10 ml量瓶中，加阿膠基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻（每1 ml含黃明膠對(duì)照藥材 100 μg），10 000 r/min離心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml離心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.3 阿膠對(duì)照藥材溶液的制備 稱取阿膠對(duì)照藥材0.1 g，加1 %碳酸氫銨溶液50 ml，超聲處理30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml離心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。另取0.1 ml超純水替代阿膠對(duì)照藥材，同法制備空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 分別取空白溶液、阿膠對(duì)照藥材溶液、牛皮特征肽A對(duì)照品溶液及黃明膠對(duì)照藥材溶液，以牛皮特征肽段m/z641.3（雙電荷）→726.2和m/z641.3（雙電荷）→783.3作為檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果牛皮特征肽A對(duì)照品溶液及黃明膠對(duì)照藥材溶液在保留時(shí)間3.5 min檢出相應(yīng)的色譜峰，而空白溶液和阿膠對(duì)照藥材溶液的提取離子流色譜圖中均無相應(yīng)的色譜峰。因此空白和阿膠對(duì)照藥材對(duì)牛皮源成分的檢測(cè)不構(gòu)成干擾，表明方法的專屬性較好，詳見圖1 A～D。

圖1 專屬性試驗(yàn)中牛皮源成分的提取離子流色譜圖

2.4.2 重復(fù)性 按2.3.1和2.3.2項(xiàng)下方法分別制備牛皮特征肽A對(duì)照品溶液及黃明膠對(duì)照藥材溶液各6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果牛皮特征肽A對(duì)照品m/z641.3（雙電荷）→783.3和m/z641.3（雙電荷）→726.2 MRM色譜峰面積的平均值（n=6）分別為108 839和130 251，RSD分別為1.1 %和1.5 %；黃明膠對(duì)照藥材溶液MRM色譜峰面積的平均值（n=6）分別為58 234和69 905，RSD分別為2.6 %和2.1 %。結(jié)果表明重復(fù)性較好，0.3 μg/ml牛皮特征肽A對(duì)照品溶液MRM色譜峰面積的平均值約為100 μg/ml黃明膠對(duì)照藥材溶液的1.9倍。

2.4.3 線性關(guān)系考察

2.4.3.1 牛皮特征肽A對(duì)照品 取牛皮特征肽A對(duì)照品16 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加阿膠基質(zhì)溶液釋至刻度，搖勻，按2.3.1項(xiàng)下方法酶解處理并進(jìn)樣測(cè)定。以牛皮特征肽A對(duì)照品的濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以m/z641.3（雙電荷）→726.2通道的MRM色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性方程為Y=436 508.5C-57.0，相關(guān)系數(shù)r為1.0000，表明在0.016～0.65 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.3.2 黃明膠對(duì)照藥材 取黃明膠對(duì)照藥材約100 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氫銨溶液40 ml，超聲40 min，放冷，加1 %碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取0.1，0.2，0.3，0.5，1.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加阿膠基質(zhì)溶液釋至刻度，搖勻，按2.3.2項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測(cè)定。以黃明膠對(duì)照藥材的濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以m/z641.3（雙電荷）→726.2通道的MRM色譜峰積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性方程為Y=688.2C-193.6，相關(guān)系數(shù)r為0.9996，即在20.83～208.26 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 模擬樣品的檢測(cè)

稱取阿膠對(duì)照藥材0.1 g，精密加入黃明膠對(duì)照藥材7.5 mg，按2.3.3項(xiàng)下方法處理，平行制備6份含牛皮源成分的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6份供試品溶液中均檢出m/z641.3（雙電荷）→783.3和m/z641.3（雙電荷）→726.2 MRM色譜峰，其峰面積的平均值（n=6）分別為86 291和102 871，RSD為3.4 %和4.6 %。

3 討論

3.1 色譜系統(tǒng)的優(yōu)化

阿膠中牛皮源含量補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的色譜洗脫時(shí)間為40 min，加上色譜系統(tǒng)的再平衡時(shí)間，整個(gè)采集時(shí)間近45 min。本研究采用柱長(zhǎng)為50 mm、填料粒徑為1.7 μm的超高效色譜柱替代原標(biāo)準(zhǔn)的柱長(zhǎng)為100 mm、粒徑為1.8 μm的色譜柱?；谔鎿Q的色譜柱其柱長(zhǎng)更短、粒徑更小，在保證方法分離效果的基礎(chǔ)上，經(jīng)不斷調(diào)整梯度洗脫程序，最終將補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的梯度洗脫程序由“0～25 min，5 %A～20 %A；25～40 min，20 %A～50 %A”改為“0～10 min，5 %A～11 %A；10～11 min，11 %A～80 %A；11～13 min，80 %A；13～13.01 min，80 %A～5 %A；13.01～15 min，5 %A”，A為乙腈，B為0.1 %甲酸溶液，將總采集時(shí)間控制為15 min，有效縮短了分析時(shí)間，方法學(xué)考察結(jié)果也表明方法的專屬性強(qiáng)、精密度、重復(fù)性較好，線性關(guān)系良好，可用于牛皮源成分的快速分析。

3.2 阿膠原藥材與含阿膠中成藥中牛皮源成分判定標(biāo)準(zhǔn)問題

阿膠原藥材（取樣0.1 g）采用0.3 μg/ml的牛皮特征肽A對(duì)照品，而阿膠補(bǔ)血膏和阿膠補(bǔ)血口服液（相當(dāng)于阿膠原藥材0.1g）則采用100 μg/ml的黃明膠對(duì)照藥材。重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以m/z641.3（雙電荷）→726.2提取的MRM色譜圖中，牛皮特征肽A對(duì)照品溶液MRM色譜峰面積約為黃明膠對(duì)照藥材溶液的1.9倍。即阿膠原藥材中牛皮源成分限度要求比阿膠補(bǔ)血膏及阿膠補(bǔ)血口服液等中成藥明顯寬松。模擬供試品溶液中均檢出牛皮源成分，其m/z641.3（雙電荷）→726.2提取的MRM色譜峰面積值均低于牛皮特征肽A對(duì)照品溶液中相應(yīng)的峰面積值，但卻高于黃明膠對(duì)照藥材制備的牛皮源成分對(duì)照溶液相應(yīng)的峰面積值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，前者應(yīng)判定為未檢出牛皮源成分，而后者則判定為檢出牛皮源成分。因此有必要將阿膠原藥材與阿膠中成藥中牛皮源成分的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一。建議將阿膠藥材中牛皮特征肽A對(duì)照品的濃度降低1.9倍，亦或采用100 μg/ml的黃明膠對(duì)照藥材作為牛皮源成分的對(duì)照溶液。

3.3 阿膠與其他膠類藥材牛皮源成分判定標(biāo)準(zhǔn)問題

阿膠原藥材（取樣0.1 g）采用0.3 μg/ml的牛皮特征肽A對(duì)照品作為牛皮源成分對(duì)照溶液，而龜甲膠（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：2014013）[8]和鹿角膠（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：2014014）[9]等膠類原藥材（取樣0.1 g）中牛皮源成分補(bǔ)充檢驗(yàn)方法則采用100 μg/ml的黃明膠對(duì)照藥材作為牛皮源成分的對(duì)照溶液，即阿膠原藥材中牛皮源成分限度比龜甲膠、鹿角膠等膠類藥材更為寬松，本著合理監(jiān)管的角度，建議阿膠中牛皮源成分的限度從嚴(yán)控制，從而與其他膠類藥材的判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。

3.4 不同牛皮源成分參比品的比較

牛皮特征肽A對(duì)照品屬于多肽類產(chǎn)品，穩(wěn)定性較差，需要在-20 ℃以下冷凍保存，日常使用中運(yùn)輸要求較高且對(duì)照品的價(jià)格較為昂貴，而黃明膠對(duì)照藥材在室溫下即可穩(wěn)定保存且價(jià)格較便宜。本著穩(wěn)定性、易獲得性和經(jīng)濟(jì)性的考慮，建議“阿膠中牛皮源含量的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法”修訂為采用黃明膠對(duì)照藥材制備牛皮源成分參比溶液。

4 結(jié)論

本文對(duì)阿膠原藥材及含阿膠中成藥中牛皮源成分檢查補(bǔ)充檢驗(yàn)方法進(jìn)行了優(yōu)化，將分析時(shí)間由40 min縮短至15 min，有效提高了分析速度。同時(shí)對(duì)阿膠原藥材標(biāo)準(zhǔn)中采用的牛皮特征肽A對(duì)照品和阿膠補(bǔ)血膏及阿膠補(bǔ)血口服液中采用的黃明膠對(duì)照藥材進(jìn)行了考察，結(jié)果表明二者的m/z641.3（雙電荷）→726.2 MRM色譜峰面積值相差約1.9倍。相同樣品量下將會(huì)導(dǎo)致阿膠原藥材與中成藥中牛皮源成分的判定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，本著嚴(yán)格監(jiān)管的原則，同時(shí)從對(duì)照品的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性上考慮，建議阿膠中牛皮源檢查補(bǔ)充檢驗(yàn)方法修訂為采用100 μg/ml的黃明膠對(duì)照藥材制備牛皮源成分的參比溶液。