王月清
(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 江北院區(qū)藥劑科,江蘇 南京 210048)
消風(fēng)止癢顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊》,具有消風(fēng)清熱,除濕止癢的作用。主治丘疹樣蕁麻疹及濕疹、皮膚瘙癢癥[1]。該中成藥由防風(fēng)、荊芥、蒼術(shù)、地黃、當(dāng)歸、木通、蟬蛻、亞麻子、地骨皮、石膏、甘草11味藥材組成,目前,該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對防風(fēng)及木通兩味藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別及顆粒劑項(xiàng)下的常規(guī)檢查,并無含量測定項(xiàng)控制,涉及藥材有限,專屬性差,不能全面評價(jià)消風(fēng)止癢顆粒的質(zhì)量。文獻(xiàn)報(bào)道中對于消風(fēng)止癢顆粒的定量都以1~2個(gè)成分為指標(biāo)進(jìn)行測定[2-3]。消風(fēng)止癢顆粒中防風(fēng)辛甘性溫,散表寒,擅于祛一切之風(fēng),荊芥味辛性溫,兩者合為君藥,疏風(fēng)以止癢[4-5];蒼術(shù)辛苦而溫,健脾燥濕,祛濕止癢,地黃、當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血、活血,可增防風(fēng)、荊芥驅(qū)風(fēng)之力,合為臣藥[6-8];木通、蟬蛻、亞麻子、地骨皮、石膏俱為佐藥,能清熱利濕、透疹除癢[9-10];甘草清熱解毒,調(diào)和諸藥為使藥[11]。根據(jù)《中國藥典》對于單味中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),防風(fēng)的指標(biāo)成分為升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷,荊芥的指標(biāo)成分為胡薄荷酮,當(dāng)歸的指標(biāo)成分為阿魏酸,蒼術(shù)的指標(biāo)成分為蒼術(shù)素,地黃的指標(biāo)成分為梓醇與毛蕊花糖苷,甘草的指標(biāo)成分為甘草苷與甘草酸銨,確定采用9種化學(xué)成分控制該中成藥的質(zhì)量。因此,本研究從多種有效成分同時(shí)監(jiān)控的角度出發(fā),采用反相高效液相色譜(RP-HPLC),通過波長切換法,同時(shí)測定上述9種化學(xué)成分含量,為消風(fēng)止癢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。
Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,包括 G1311A四元梯度泵,G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1314B-DAD檢測器,G1316A柱溫箱,Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng));CPA225D電子天平(d=0.01 mg,德國賽多利斯公司)。
梓醇對照品(批號(hào):110808-201711,含量:99.6 %),阿魏酸對照品(批號(hào):110773-201915,含量:99.4 %),毛蕊花糖苷對照品(批號(hào):111530-201914,含量:95.2 %),蒼術(shù)素對照品(批號(hào):111924-201806,含量:99.5 %),升麻素苷對照品(批號(hào):111522-201913,含量:94.6 %),5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號(hào):111523-201811,含量:97.4 %),胡薄荷酮對照品(批號(hào):111706-201907,含量:99.4 %),甘草苷對照品(批號(hào):111610-201908,含量:95.0 %),甘草酸銨對照品(批號(hào):110731-202021,含量:96.2 %,中國食品藥品檢定研究院);甲醇、乙腈均為色譜純,其他試劑均為分析純,水為娃哈哈純凈水。市售消風(fēng)止癢顆粒8批,規(guī)格:8 g/袋,分別購自陜西華西制藥股份有限責(zé)任公司(批號(hào):20191121,20200407,20200529,20200618)及吉林紫鑫藥業(yè)有限公司(批號(hào):20191212,20200325,20200418,20200602)。
2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨對照品各適量,分別置20 ml棕色量瓶中,加甲醇溶解稀釋至刻度,得含梓醇226.9 μg/ml、阿魏酸116.5 μg/ml、毛蕊花糖苷211.3 μg/ml、蒼術(shù)素100.7 μg/ml、升麻素苷127.2 μg/ml、5-O-甲基維斯阿米醇苷124.8 μg/ml、胡薄荷酮200.5 μg/ml、甘草苷94.81 μg/ml和甘草酸銨102.9 μg/ml的混合對照品溶液,室溫避光保存,備用。
2.1.2 供試品溶液的制備 取消風(fēng)止癢顆粒10袋,研勻,稱取細(xì)粉約4.0 g,精密稱定,置100 ml棕色量瓶中,加入85 %甲醇溶液約80 ml,20 ℃超聲處理(450 W,40 kHz)45 min,取出,放冷至室溫,用85 %甲醇稀釋至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。
2.1.3 陰性對照溶液的制備 按消風(fēng)止癢顆粒的處方比例,分別制備缺防風(fēng)、荊芥、蒼術(shù)、當(dāng)歸、地黃、甘草的陰性樣品,并按2.1.2項(xiàng)下方法分別制備陰性對照溶液。
色譜柱:Waters XTERRA C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-1.5 mmol/L KH2PO4溶液(稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5)(25:75)(B),梯度洗脫,程序見表1。流速:1.0 ml/min,柱溫35 ℃。
表1 梯度洗脫程序
分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl注入色譜儀,色譜記錄時(shí)間:50 min,理論塔板數(shù)以梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰計(jì)均大于4800,各待測成分與前后峰分離度均大于1.5,各峰的對稱因子均在0.93~1.14之間,色譜圖見圖1。
圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜
分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對照品儲(chǔ)備液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0 ml,置于同一25 ml棕色量瓶中,加甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,得系列混合對照品溶液,精密吸取上述系列混合對照品溶液,按2.2項(xiàng)下色譜條件測定,記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/ml),峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明:梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,見表2。
將對照品溶液逐級(jí)稀釋后,以信噪比(S/N)約為3.0 時(shí)的濃度為各成分的檢測限(LOD),S/N約為10.0 時(shí)的濃度為各成分的定量限(LOQ)。結(jié)果見表2。
表2 線性關(guān)系考察結(jié)果
精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液10 μl,按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別0.95 %,1.02 %,0.85 %,0.91 %,0.82 %,0.88 %,0.96 %,0.79 %,0.59 %(n=6),表明儀器精密度良好。
取同一消風(fēng)止癢顆粒供試品溶液(批號(hào):20200529),分別于制備后0,3,6,9,15,20,24 h,按2.2項(xiàng)下色譜條件測定,記錄峰面積。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.23 %,1.06 %,0.97 %,1.09 %,0.89 %,0.78 %,0.92 %,0.57 %,0.81 %(n=7),表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
取同一批消風(fēng)止癢顆粒(批號(hào):20200529)6份,按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按2.2項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的平均質(zhì)量濃度分別為0.4117,0.2433,0.4002,0.1588,0.2571,0.2539,0.3856,0.1007,0.1265 mg/g,RSD分別0.99 %,0.81 %,1.06 %,1.01 %,1.14 %,0.78 %,1.32 %,1.05 %,1.03 %(n=6),表明方法重復(fù)性良好。
取已知含量的消風(fēng)止癢顆粒(批號(hào):20200529)細(xì)粉6份,每份約2.0 g,精密稱定,分別置于100 ml棕色量瓶中,精密加入梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨混合對照品溶液(濃度分別為0.2269,0.1165,0.2113,0.1007,0.1272,0.1248,0.1029,0.09481,0.1029 mg/ml)4.0 ml,按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液方法制備,再按2.2項(xiàng)下色譜條件測定,記錄色譜圖,計(jì)算平均加樣回收率分別為99.74 %,99.21 %,99.54 %,99.03 %,99.91 %,98.99 %,100.04 %,98.79 %,99.09 %,RSD分別為0.55 %,0.92 %,0.69 %,0.81 %,1.13 %,0.72 %,1.14 %,0.59 %,0.68 %(n=6),表明該方法準(zhǔn)確可靠,具體數(shù)據(jù)見表3。
表3(續(xù))
分別考察了3種不同品牌色譜柱(Waters XTERRA C18、Agilent Zorbax C18、Welch ultimate xb-C18,規(guī)格均為250 mm×4.6 mm,5 μm)對消風(fēng)止癢顆粒含量的影響。結(jié)果在不同色譜柱上測得梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的含量RSD依次為1.07 %,1.13 %,1.09 %,1.22 %,0.98 %,1.16 %,1.38 %,1.46 %,1.25 %,RSD均小于2.0 %,表明此方法耐用性較好。
取8批消風(fēng)止癢顆粒樣品,按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.2項(xiàng)下色譜條件測定,外標(biāo)法計(jì)算樣品中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的質(zhì)量濃度,結(jié)果見表4。8批次消風(fēng)止癢顆粒中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.4101~0.4359 mg/g,0.2409~0.2448 mg/g,0.3989~0.5109 mg/g,0.1571~0.1599 mg/g,0.2557~0.2582 mg/g,0.2511~0.2551 mg/g,0.3842~0.3866 mg/g,0.1001~0.1018 mg/g,0.1251~0.1276 mg/g。結(jié)果表明消風(fēng)止癢顆粒各批次之間9種成分的含量基本穩(wěn)定。
表4 消風(fēng)止癢顆粒中9種成分含量的結(jié)果(n=3)
本實(shí)驗(yàn)利用DAD在190~400 nm波段范圍內(nèi)掃描,得到蒼術(shù)素、阿魏酸與毛蕊花糖苷最大吸收波長為330 nm;甘草苷與甘草酸銨最大吸收波長為237 nm;升麻素苷與 5-O-甲基維斯阿米醇苷最大吸收波長為254 nm,胡薄荷酮最大吸收波長為252 nm。254 nm雖不是胡薄荷酮的最大吸收波長,但在此波長下,胡薄荷酮、升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷峰形比較理想,雜質(zhì)峰干擾較小,能達(dá)到方法學(xué)考察要求,因此選擇在254 nm下測定胡薄荷酮、升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷3個(gè)組分,故研究采用分段變換波長檢測法對9種成分進(jìn)行測定。
研究中考察對比了不同流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇-水溶液、甲醇-磷酸溶液、甲醇-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-磷酸二氫鈉溶液)、柱溫(30、35、40 ℃)對分離效果的影響,最終確定了2.2項(xiàng)下色譜條件。
本研究共測定兩個(gè)廠家8個(gè)批次的消風(fēng)止癢顆粒,均檢測出梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨9個(gè)成分,結(jié)果表明同一廠家生產(chǎn)的不同批次產(chǎn)品中9種成分的含量差異不大,不同廠家產(chǎn)品中梓醇和毛蕊花糖苷含量有一定差異,這可能與不同廠家地黃的藥材品種和質(zhì)量有關(guān)。
本研究首次建立HPLC同時(shí)測定消風(fēng)止癢顆粒中9種成分的方法,操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確,可作為消風(fēng)止癢顆粒多指標(biāo)定量測定方法。