HPLC測(cè)定利奈唑胺原料藥中3個(gè)降解雜質(zhì)

彭相君，于麗萍，路 易

（1. 日照市第二人民醫(yī)院，山東 日照 276807；2. 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400）

利奈唑胺（linezolid）為全合成的噁唑烷酮類(lèi)抗菌藥，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。利奈唑胺對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌特別是多重耐藥的革蘭陽(yáng)性球菌有良好的抗菌活性，對(duì)葡萄球菌、鏈球菌敏感[1-3]。由于利奈唑胺具有獨(dú)特的作用位點(diǎn)和方式，不易與其他抗菌藥產(chǎn)生交叉耐藥性，在臨床上用于革蘭陽(yáng)性菌引起的肺炎、皮膚軟組織感染、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、菌血癥、骨髓炎和外科手術(shù)感染等的治療[4-5]。

利奈唑胺分子結(jié)構(gòu)中存在酯鍵和酰胺鍵，在貯存過(guò)程中可能產(chǎn)生降解，有文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，利奈唑胺在堿性環(huán)境下主要降解產(chǎn)物為雜質(zhì)I與雜質(zhì)II；酸性環(huán)境下主要降解產(chǎn)物為雜質(zhì)III。其降解過(guò)程見(jiàn)圖1。本研究建立梯度洗脫方法，同時(shí)測(cè)定利奈唑胺中雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III，采用對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算3種雜質(zhì)的含量，定量準(zhǔn)確，為利奈唑胺的雜質(zhì)控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；Mettler Toledo 205電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

利奈唑胺對(duì)照品（純度：99.7 %，批號(hào)：DZ170201），雜質(zhì)I對(duì)照品（純度：99.5 %，批號(hào)：DZ170207），雜質(zhì)II對(duì)照品（純度：99.8 %，批號(hào)：DZ170208），雜質(zhì)III對(duì)照品（純度：99.5 %，批號(hào)：DZ170209），利奈唑胺原料藥（批號(hào)：190301，190302，190303，臨沂萊博科技公司）；乙腈為色譜純，三氟乙酸為優(yōu)級(jí)純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1 %三氟乙酸乙腈溶液，B相為0.1 %三氟乙酸水溶液，線性梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 10 μl。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品貯備液 分別精密稱(chēng)取利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III對(duì)照品各約100 mg，置100 ml量瓶中，用溶劑（流動(dòng)相A:流動(dòng)相B=10:90）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 μg/ml的對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密量取上述對(duì)照品貯備液各1.0 ml，置同一100 ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為10 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液 精密量取對(duì)照品貯備液各適量，用溶劑定量稀釋制成含利奈唑胺約1000 μg/ml，含雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III均約1 μg/ml的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱(chēng)取利奈唑胺原料藥約100 mg，置100 ml量瓶中，用溶劑溶解并定容，即得濃度為1000 μg/ml的供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下溶劑、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。色譜圖中各色譜峰均分度良好，各色譜峰的理論板數(shù)均在5000以上。

圖2 專(zhuān)屬性色譜圖

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取利奈唑胺原料藥，分別進(jìn)行下列試驗(yàn)：（1）酸降解試驗(yàn)：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的鹽酸溶液5 ml，室溫放置5 h，精密加入1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml中和，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（2）堿降解試驗(yàn)：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液5 ml，80 ℃水浴加熱10 min，放冷，精密加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml中和，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（3）氧化降解試驗(yàn)：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入3 %過(guò)氧化氫3 ml，搖勻，室溫放置5 h，強(qiáng)烈振搖至無(wú)氣泡產(chǎn)生，再加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（4）高溫降解試驗(yàn)：取利奈唑胺原料藥適量，置稱(chēng)量瓶中，置烘箱中，于130 ℃加熱3 h，取出，放冷，精密稱(chēng)取25 mg，置25 ml量瓶中，加入溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻；（5）光照降解試驗(yàn)：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，倒入石英吸收皿中，置澄明度檢測(cè)儀下，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度為4000 lx，放置24 h。取以上降解試驗(yàn)溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，利奈唑胺在酸、堿、氧化條件下有關(guān)物質(zhì)的含量均增加，在高溫和光照條件下較穩(wěn)定。其中酸性與堿性條件影響較顯著，在酸性條件下水解，主要產(chǎn)生雜質(zhì)III；在堿性條件下，主要生成雜質(zhì)I和雜質(zhì)II。各降解物色譜峰與主峰間均能良好分離。

圖3 降解試驗(yàn)色譜圖

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III對(duì)照品貯備溶液適量，用溶劑分別稀釋制得濃度為0.1，0.5，1，5，10 μg/ml的系列溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液濃度c（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)（r）結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的線性關(guān)系良好。

2.6 定量限與檢測(cè)限

取利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III對(duì)照品貯備溶液，用溶劑逐步稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以S/N=10求得利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的定量限（LOQ），以S/N=3求得利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 利奈唑胺及各雜質(zhì)的線性試驗(yàn)、LOD和LOQ結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.5項(xiàng)下對(duì)照品溶液（濃度為1 μg/ml），重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算利奈唑胺、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III各色譜峰峰面積的RSD分別為0.47 %，0.23 %，0.38 %和0.32 %。表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取利奈唑胺原料藥100 mg，按2.2.4項(xiàng)下方法配制供試品溶液，于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III峰面積的RSD分別為1.36 %，1.49 %和1.65 %。表明樣品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取利奈唑胺原料藥100 mg，共6份，按2.2.4項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的含量，結(jié)果雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III含量的RSD分別為1.75 %，1.51 %和1.58 %。表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)得各雜質(zhì)含量的利奈唑胺原料藥（批號(hào)：190301）約50 mg，共9份，各置100 ml量瓶中，分別加入雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III對(duì)照品貯備溶液適量，配制成約相當(dāng)于各雜質(zhì)濃度水平50 %，100 %和150 %的溶液，各3份，作為加樣回收率試驗(yàn)溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的平均回收率分別為97.36 %，96.76 %和95.54 %，RSD分別為1.62 %，1.22 %和1.82 %。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.11 樣品測(cè)定

取利奈唑胺原料藥3批，按2.2.4項(xiàng)下方法分別配制供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，采用對(duì)照品外標(biāo)法分別計(jì)算雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本文采用梯度洗脫，在流動(dòng)相中加入0.1 %三氟乙酸，各色譜峰分離良好，峰形尖銳且對(duì)稱(chēng)，柱效較高。采用二極管陣列檢測(cè)器，各物質(zhì)在254 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)的紫外吸收，因此選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 溶劑的選擇

對(duì)照品溶液與供試品溶液的配制溶劑均采用初始梯度時(shí)流動(dòng)相的比例，即流動(dòng)相A:流動(dòng)相B=10:90。用初始梯度流動(dòng)相溶解樣品，可避免各色譜峰前延或托尾的現(xiàn)象，使峰形正態(tài)，積分準(zhǔn)確。

3.3 方法耐用性考察

參照《中國(guó)藥典》2020年版中對(duì)方法耐用性的要求[11]，對(duì)2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行微小調(diào)整，通過(guò)改變柱溫（25 ℃、35 ℃及室溫）、流速（0.8 ml/min及1.2 ml/min）、檢測(cè)波長(zhǎng)（252 nm，256 nm）與色譜柱品牌型號(hào)等試驗(yàn)條件，考察該方法的耐用性。結(jié)果顯示以上色譜條件變化對(duì)分離效果影響不大。

利奈唑胺在存放過(guò)程中可能產(chǎn)生降解產(chǎn)物，通過(guò)查閱文獻(xiàn)及對(duì)利奈唑胺原料藥在酸、堿、氧化、高溫和強(qiáng)光照射條件下的破壞試驗(yàn)，雜質(zhì)I、雜質(zhì)II和雜質(zhì)III是利奈唑胺的主要降解雜質(zhì)。本文建立HPLC方法，對(duì)利奈唑胺中3種主要降解雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，為利奈唑胺質(zhì)量控制提供參考。