蕓豆酵素復(fù)合發(fā)酵工藝優(yōu)化及功能性分析

王 迪 王 穎,2,3 張艷莉 佐兆杭劉淑婷 張 裕 李志芳

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(國家雜糧工程技術(shù)研究中心；黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,大慶 163319)(糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、藥食同源食材等為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵制得的富含酶、益生菌、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)物質(zhì)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[1,2]。食用酵素既可最大程度保留植物原料的營養(yǎng)成分，又可通過有益微生物的代謝產(chǎn)生功能性小分子活性物質(zhì)。食用酵素具有減肥降血脂[3,4]、解酒護(hù)肝[5]、美白抗氧化[6-8]、防治心血管疾病[9]等功效。以谷物作為益生菌載體的食用酵素可以解決傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品高脂高膽固醇等問題，同時為乳糖不耐癥人群攝入益生菌提供新思路。目前研究多集中在工藝優(yōu)化及功能性分析方面。洪厚勝等[10]利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌多菌種共同發(fā)酵葡萄果渣并優(yōu)化工藝參數(shù)，經(jīng)測定葡萄果渣酵素SOD活力可達(dá)988 U/mL，相較于發(fā)酵前提高了1.19倍。王輝等[11]探究青梅酵素生物活性及抑菌性，結(jié)果表明其抗氧化性及酶活性較強(qiáng)，對致病菌有明顯抑制作用。

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn)學(xué)名菜豆，又名四季豆，廣泛種植于內(nèi)蒙古、云南、黑龍江、遼寧等11個省、自治區(qū)，已成為栽培面積僅次于黃豆的食用豆類農(nóng)作物[12]。蕓豆富含蛋白質(zhì)、B族維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時含有多種人體必需氨基酸，其中賴氨酸和色氨酸含量相對較高[13,14]。蕓豆中α-淀粉酶抑制劑可有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠高脂血癥、胰島素抵抗并提高其機(jī)體免疫力，降低機(jī)體氧化應(yīng)激及高血糖靈敏度，并以低毒性有效防止血管組織的病變[15-17]；蕓豆多肽，如凝集素、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑、抗真菌蛋白等，可用于抵御如真菌和細(xì)菌等病原微生物及食肉昆蟲對植物的侵害[18]；蕓豆抗性淀粉具有防預(yù)治療胃損傷、糖尿病、腸癌等功效[19,20]。蕓豆富含的多種生物活性物質(zhì)在疾病防治方面具有巨大潛力，還可被作為天然的抗氧化劑、色素、甜味劑應(yīng)用于食品、化妝品、藥品等相關(guān)行業(yè)，以安全性高、來源廣泛、見效迅速的優(yōu)點(diǎn)，在人類生活中扮演重要角色[21,22]。

蕓豆主要以鮮食為主，存在綜合利用程度低及高值轉(zhuǎn)化差等問題，目前鮮見復(fù)合益生菌發(fā)酵蕓豆酵素的研究，其工藝優(yōu)化及功能性也鮮有報道。因此，本研究以黑龍江省地區(qū)主產(chǎn)紫花蕓豆為研究對象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化蕓豆酵素發(fā)酵工藝參數(shù)，探究其抗氧化活性及體外抑菌性，以期提高蕓豆附加值，同時為蕓豆酵素系列產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆；白砂糖；活性干酵母；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；志賀氏菌(Shigella)；大腸桿菌(Escherichiacoli)；沙門氏菌(Salmonella)；耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)；糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒；羥自由基試劑盒；福林酚(10%)。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-Y912料理機(jī)，S220 pH計，H1850R冷凍離心機(jī)，BCV-6S1超凈工作臺，DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，V-5100B可見分光光度計，YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

蕓豆去皮清洗→打漿均質(zhì)→液化→糖化→離心→滅菌→接種→發(fā)酵→后發(fā)酵

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酵母菌、乳酸菌

1.3.2 操作要點(diǎn)

菌種的活化與培養(yǎng):取甘油保存的菌液100 μL于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，無菌操作臺中劃線接入MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃，24 h)，連續(xù)接種3代，使其充分活化。挑取斜面培養(yǎng)基生長較好菌落接種至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃，24 h)，搖勻后移取1%菌液至液體培養(yǎng)基(37 ℃，24 h)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的乳酸菌菌懸液，待用。活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，菌液待用。

蕓豆清汁的發(fā)酵：紫花蕓豆清洗后去皮，按1∶3(g/mL)料水比打漿。雙酶法進(jìn)行水解，液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH 6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件：加酶量200μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機(jī)中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調(diào)清汁pH 5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%后滅菌。冷卻后接種0.2%酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，按1∶1(共同發(fā)酵)比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌恒溫發(fā)酵24 h。-4 ℃后發(fā)酵并保藏備用。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計

蕓豆清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后滅菌，接種3%復(fù)配乳酸菌，32 ℃發(fā)酵24 h，測定蕓豆酵素SOD活力。固定其他條件，分別考察糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度對發(fā)酵液SOD活力的影響。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計

利用Design-Expert 8.06軟件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度4個單因素為自變量，發(fā)酵液SOD活力為響應(yīng)值，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.5 SOD酶活力測定

使用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒測定。

1.3.6 抗氧化實(shí)驗(yàn)1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL樣品溶液與2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混勻，室溫下暗反應(yīng)30 min，空白組以無水乙醇代替試樣，517 nm處測定樣品吸光度值[23]。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用無水乙醇代替DPPH時測得對應(yīng)濃度的本底吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力測定

使用羥自由基測試試劑盒測定。

1.3.7 蕓豆酵素體外抑菌活性測定1.3.7.1 菌懸液的制備

無菌條件下，將金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化兩次。取1環(huán)活化后菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，菌懸液重懸稀釋后進(jìn)行平板計數(shù)，使菌懸液中菌數(shù)保持在1×107～2×107CFU/mL，備用。

1.3.7.2 蕓豆酵素抑菌活性的測定

吸取100 μL菌懸液于LB固體培養(yǎng)基上，涂布器涂開。打孔器在固體培養(yǎng)基上打孔，分別吸取20、40、80、160、320 mg/mL的蕓豆酵素0.2 mL于孔中，無菌水為空白對照。培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1可知，SOD活力隨糖添加量增加而升高，超過一定范圍后下降，推測發(fā)酵液滲透壓增高，造成細(xì)胞壁特性發(fā)生改變，同時抑制細(xì)胞膜上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等物質(zhì)活性，影響細(xì)胞膜流動性[24]。此外，菌種細(xì)胞收縮及胞內(nèi)水流出，造成生長周期停滯和凋亡等多種生物過程的破壞[25]，致使發(fā)酵無法正常進(jìn)行。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SOD活力隨著初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢，推測SOD化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，其分子內(nèi)部規(guī)律性結(jié)構(gòu)易受pH、溫度等物理或化學(xué)因素影響，導(dǎo)致氫鍵斷裂進(jìn)而空間結(jié)構(gòu)被破壞，酶活性降低。

增大接種量，SOD活力未增加卻大幅度降低，推測接種量過低，易污染雜菌形成不利于菌種增殖生長的環(huán)境[26]；接種量過高，菌體發(fā)酵速度過快，易造成微生物細(xì)胞衰老而自溶，影響風(fēng)味。

隨著發(fā)酵溫度的升高，SOD活力逐漸增大，而溫度過高時SOD活力呈降低趨勢，分析原因溫度升高加快微生物繁殖代謝。但過高縮短發(fā)酵周期，同時改變氣體傳遞速率及溶解度，降低發(fā)酵液溶氧量，影響微生物正常生長代謝。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 響應(yīng)面結(jié)果及分析

響應(yīng)面設(shè)計各因素水平的蕓豆酵素SOD活力見表2。對表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=215.63+1.58A-2.18B+5.24C+2.97D-1.94AB-1.80AC-4.28AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.79A2-18.30B2-19.65C2-11.23D2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析及結(jié)果

方程一次項(xiàng)中C項(xiàng)對蕓豆酵素SOD酶活力的影響達(dá)到極度顯著水平(P<0.000 1)，B項(xiàng)和D項(xiàng)達(dá)到高度顯著水平(P<0.01)，A項(xiàng)達(dá)到顯著水平(P<0.05)，即各因素對蕓豆酵素SOD活力影響順序依次為初始pH>接種量>糖添加量>發(fā)酵溫度。

2.1.2 交互作用分析

各因素交互作用等高線圖呈橢圓形，說明交互作用顯著。響應(yīng)面對比可知，初始pH、糖添加量和接種量曲面彎曲程度較大，表明對發(fā)酵液SOD活力影響顯著，與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。經(jīng)Design Expert 8.06優(yōu)化蕓豆酵素發(fā)酵工藝參數(shù)：糖添加量6.08%，初始pH 3.94，接種量3.23%，發(fā)酵溫度為32.53 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力預(yù)測值可達(dá)216.213 U/mL。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性，考慮到實(shí)踐操作可行性，優(yōu)化工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度32 ℃、糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量3%，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到蕓豆酵素SOD活力為215.12U/mL(誤差0.51%)，證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性。

2.2 不同發(fā)酵階段蕓豆酵素抗氧化活性分析

2.2.1 不同發(fā)酵階段蕓豆酵素DPPH自由基清除率變化

蕓豆酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化如圖2所示。整個發(fā)酵過程中蕓豆酵素均對DPPH自由基具有一定的清除能力，呈現(xiàn)先迅速上升后趨于平緩的趨勢。與發(fā)酵0 h相比，發(fā)酵8 h的蕓豆酵素DPPH自由基清除率迅速增長2倍，隨后以小幅度趨勢增長，說明適當(dāng)延長發(fā)酵時間可明顯提高蕓豆酵素DPPH自由基清除能力。發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率顯著上升，至發(fā)酵結(jié)束達(dá)90.57%，分析原因可能與酚類物質(zhì)有關(guān)，其較容易給出一個氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定[27]，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生如超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶，兩者共同作用是高DPPH自由基清除率的原因。

圖2 蕓豆酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

2.2.2 不同發(fā)酵階段蕓豆酵素羥基自由基清除率變化

蕓豆酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化情況如圖3所示。羥基自由基的清除能力隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，最終增長至88.06%。羥基自由基清除能力的提高可能是由于有機(jī)酸、維生素具有自由羥基的酚類物質(zhì)，A環(huán)或B環(huán)上有自由的3-羥基取代或有多羥基取代的黃酮化合物，多酚類物質(zhì)分子內(nèi)含大量的酚羥基，提供活潑的氫，可終止自由基連鎖反應(yīng)[28]。多種因素共同作用提高發(fā)酵液自由基清除能力。

圖3 蕓豆酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化

2.3 蕓豆酵素抑菌活性分析

由圖4和表4可知，蕓豆酵素對4種致病菌均有抑制作用，隨著濃度升高抑菌圈直徑顯著增大(P<0.05)。當(dāng)蕓豆酵素濃度為320 mg/mL時，均處于15～20 mm的高敏范圍。其中，相較于革蘭氏陰性菌(沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌)，蕓豆酵素對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑制效果更強(qiáng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果相一致[29]。原因在于供試菌種細(xì)胞壁組成不同，革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁大部分由位于表面的肽聚糖構(gòu)成，溶菌酶等抑菌成分可直接作用其表面進(jìn)而抑制肽聚糖的合成并溶解細(xì)菌。而陰性菌細(xì)胞壁主要成分為脂多糖和脂蛋白，可一定程度防止其細(xì)胞結(jié)構(gòu)被外界破壞[29]。

圖4 蕓豆酵素產(chǎn)生的抑菌圈效果圖

表4 不同濃度蕓豆酵素的抑菌活性

3 結(jié)論

蕓豆酵素發(fā)酵最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵溫度32 ℃、糖添加量6%、初始pH4.0、接種量3%，此條件下發(fā)酵液SOD活力為215.12 U/mL。發(fā)酵使蕓豆酵素DPPH自由基清除率及羥自由基清除率顯著增長，至發(fā)酵結(jié)束其清除率分別為90.57%和88.06%，證明經(jīng)工藝優(yōu)化后的蕓豆酵素具有良好的抗氧化活性。采用擴(kuò)散法考察不同濃度蕓豆酵素對致病菌抑菌效果，結(jié)果表明蕓豆酵素抑菌活性隨濃度升高而增強(qiáng)，且對革蘭氏陽性菌抑制效果更強(qiáng)。經(jīng)此工藝優(yōu)化后的蕓豆酵素色澤通透，氣味綿柔，具有良好的功能活性。