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    檢測角度對激光誘導熒光光譜技術檢測花生油AFB1污染的影響研究

    2021-09-02 09:23:52龐妍妍何學明
    中國糧油學報 2021年7期
    關鍵詞:花生油正確率光譜

    陳 敏 龐妍妍 何學明 沈 飛

    (南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院;江蘇高?,F(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210023)

    花生油顏色淡黃透明、滋味可口,具有適宜的油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸比例,易于身體消化吸收,且含有磷脂、維生素E、膽堿等對人體有益的物質(zhì),深受消費者喜愛[1]?;ㄉ鳛榛ㄉ偷脑?,在生長、收獲和貯藏過程中極易受到真菌的侵染,而霉菌代謝產(chǎn)生的AFB1在花生油生產(chǎn)過程中,會侵入油相,從而導致花生油中毒素超標,對人類健康造成嚴重的威脅[2]。

    目前,檢測AFB1的方法主要是薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法 (HPLC)[3]、酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)等[4]。 然而,這些方法通常成本高、耗時長,難以實現(xiàn)現(xiàn)場實時快速檢測。近年來,光譜技術因樣品預處理簡單、快速無損等特點成為最具有檢測潛力的一類方法[5]。其中,熒光技術因高靈敏度、特異性強、操作簡單等優(yōu)點,在農(nóng)產(chǎn)品檢測方面得到了廣泛的應用[6,7]。具有熒光特性的物質(zhì)受到紫外波段輻射激發(fā)后,會發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的可見光,稱之為熒光。對于不同物質(zhì)其分子構成不同,受輻射激發(fā)的波段、發(fā)出的熒光信號也不同。利用熒光技術檢測農(nóng)產(chǎn)品中AFB1早有報道,1969年Marsh等[8]表明棉籽AFB1與藍綠色熒光 (blue green yellow fluorescence, BGYF)具有高相關性。近年來,基于熒光技術檢測葡萄酒[9]、玉米[10]、花生[11]、面粉[12]等農(nóng)產(chǎn)品中存在的AFB1也有大量研究。與使用汞燈、發(fā)光二極管或氙燈等光源作為激發(fā)光的傳統(tǒng)熒光檢測方法相比,LIF檢測技術由于使用單一激發(fā)波長的高功率激光器,其靈敏度會更高[13]。Wu 等[14]利用研發(fā)的LIF系統(tǒng)對污染AFB1的開心果進行識別時,發(fā)現(xiàn)使用三個熒光探頭接收熒光時比只用一個熒光探頭的正確率高7%。這一結果說明當樣品受到激發(fā)光激發(fā)后,周圍均產(chǎn)生熒光。因此有相關學者研究了熒光檢測角度對實驗結果的影響。其中,有學者研究了不同角度的LIF技術檢測開心果中四種黃曲霉毒素[15]、牛奶的新鮮度[16]、橄欖油摻假[17],結果表明當激光束與檢測光纖夾角為36°時,檢測開心果黃曲霉毒素的靈敏度和信噪比最高;樣品與光束之間的角度60°時,預測牛奶新鮮度效果最好;檢測角度為90°時,橄欖油摻假預測精度最高。由此可見自主研發(fā)的LIF系統(tǒng)對不同樣品光路是有區(qū)別的,其發(fā)射的熒光信號和散射光也是具有差異性的。因此,利用LIF技術精確檢測花生油中AFB1,選擇一個合適的檢測角度是至關重要的。

    盡管有較多研究利用熒光技術檢測AFB1,而對于激光誘導熒光技術大多是鑒定食用油摻假問題,有少量報道該技術用于開心果、花生等堅果中AFB1的檢測,因花生油液體樣本復雜,受背景熒光干擾嚴重等問題,用LIF測定植物油中的AFB1尚未報道。因此,本研究擬研發(fā)一套LIF系統(tǒng),比較不同熒光角度對檢測結果的影響,探索LIF技術在檢測花生油中AFB1的應用潛力。以花生油為研究對象,分析在不同角度下,花生油污染AFB1所產(chǎn)生的特征光譜,結合化學計量學方法,建立區(qū)分AFB1污染超標花生油的定性模型,并利用定量模型探討了樣品的熒光光譜與AFB1含量的相關性。以期為實現(xiàn)花生油中AFB1的快速識別和早期預警提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料及樣品制備

    一級花生油:市售,密度為 0.9 g/mL;黃曲霉毒素標品(純度≥98%);乙腈(色譜純);振蕩器;精密量角器。

    為了驗證研發(fā)LIF系統(tǒng)檢測花生油中AFB1的可行性,優(yōu)化系統(tǒng)的光路,用乙腈配制10 000 μg/L的AFB1標準溶液備用,每個樣品用50 mL的量筒準確量取40 mL花生油,根據(jù)國標對花生油中AFB1的限量標準,制備花生油污染AFB1水平為0、5、10、20、25、30、40、50 μg/kg,每個AFB1污染水平均配制15個樣品,另外準備15個純花生油作為對照組,總計135個樣品。每個樣品均是當天配制,配制好的樣品放置在振蕩器上振蕩5 min后,在黑暗中常溫靜置2 h后再采集光譜。LIF系統(tǒng)的3個檢測角度使用量角器精確測量后固定。樣品的詳細配制情況見表1。

    表1 樣本制備的詳細情況

    1.2 實驗方法

    本研究自主研發(fā)的LIF光譜實驗裝置原理圖如圖1所示。實驗采用的是MW-GX-375的固體連續(xù)激光器作為激發(fā)光源(波長為375 nm,功率范圍0~137 mW可調(diào))。激光束通過芯徑為1 000 μm的光纖經(jīng)過準直鏡(COL-20K)垂直照射在樣品表面。置于比色皿中的20 mL樣品吸收激光能量后,釋放特征熒光經(jīng)過長波通濾光片(LPF400)到準直鏡(74-uv-02),從不同方向由芯徑為1 000 μm的光纖傳輸至光譜儀(QE pro)進行熒光光譜分析。光譜采集范圍為200~1 000 nm,積分時間設置為2 s,每個樣品采集兩次,光譜采集的整個過程均在避光的暗箱中進行,為避免環(huán)境變化對樣品采集的熒光產(chǎn)生不同影響,在實驗過程中必須保證實驗環(huán)境的一致性。

    注:1 暗箱,2 光譜儀,3 電腦,4 接收準直鏡,5 濾光片,6 樣品臺,7 樣品,8 激發(fā)準直鏡,9 光纖,10 激光器,11 電源,12 可調(diào)整檢測熒光角度(30°、60°、90°)。圖1 LIF檢測系統(tǒng)示意圖

    1.3 實驗數(shù)據(jù)處理

    采用UnscrambleX 10.4和Matlab 2015b軟件對采集的熒光光譜進行分析處理。首先,建模之前先用ken-stone(KS)算法將數(shù)據(jù)集劃分為建模樣本集(總樣本數(shù)的2/3)和預測樣本集(總樣本數(shù)的1/3)。其次,運用主成分分析 (PCA) 分析污染不同水平 AFB1花生油的聚類趨勢,在通過線性判別分析 (LDA)、偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)、支持向量機 (SVM) 將樣品劃分成不超標 (AFB1污染水平<20 μg/kg) 和超標 (AFB1污染水平≥20 μg/kg),建立偏最小二乘 (PLSR) 定量模型。評估定性模型的指標是判別正確率。評估PLSR模型性能的主要指標有:模型決定系數(shù)(R2)、建模均方根誤差(RMSEP)和預測均方根誤差(RMSEP)、相對分析誤差(residual predictive deviation, RPD)、最低檢出限(LOD)等,其中RPD為預測集標準偏差與預測均方根誤差的比值。

    2 結果與分析

    2.1 不同角度采集熒光信號的光譜分析

    污染不同水平AFB1的花生油在3個檢測角度的平均熒光原始光譜如圖2所示。同一樣品在3個角度的熒光峰形狀相似,其中對照組的峰形與0 ppb組樣品峰形基本重疊,說明用乙腈配制的AFB1標準溶液對花生油熒光信號沒有影響。當研發(fā)的LIF檢測角度為60°時,樣品熒光強度最高,而研發(fā)的LIF檢測角度為30°時,樣品熒光強度最弱且熒光峰發(fā)生紅移。圖2顯示,不同污染水平樣品在400~600 nm、600~800 nm范圍的熒光峰存在明顯差異。植物油在350~420 nm激發(fā)下出現(xiàn)在610~800 nm的熒光峰與葉綠素有關[18],而在400~600 nm的熒光峰應是由維生素B2、類胡蘿卜素以及脂肪酸的氧化產(chǎn)物等熒光團共同產(chǎn)生、疊合而成的熒光寬峰[19]。在紫外光的激發(fā)下,AFB1的熒光峰出現(xiàn)在428 nm左右[20]。從3個檢測角度采集熒光信號總體上都是隨著污染濃度的增加,熒光值也在增強,尤其是在400~600 nm,熒光強度增強幅度更大。這可能是低濃度的AFB1熒光信號會與花生油中的熒光物質(zhì)發(fā)生交叉影響[21]。盡管熒光值隨著污染濃度的增加而增強,但在400~800 nm范圍內(nèi),沒有單個特征峰可以直接表示與AFB1相關,因此,為了提取與AFB1污染有關的關鍵光譜信息,需要借助化學計量學方法進一步分析400~800 nm的光譜。

    2.2 主成分分析

    利用所研發(fā)的LIF系統(tǒng)采集污染AFB1花生油的3個檢測角度的主成分分析結果如圖3所示。總體而言,超標花生油和不超標花生油在主成分得分圖上并不能完全區(qū)分開,尤其是當研發(fā)的LIF系統(tǒng)檢測角度為30°時,分離效果最差。這可能是由于熒光在30°檢測時受到散射效應的影響最大。也可能是微量的AFB1在花生油中熒光信號強度較低,而花生油本身的熒光容易掩蓋AFB1特性信號[22]。當研發(fā)的LIF系統(tǒng)檢測角度為60°和90°時,PC1和PC2 兩個主成分貢獻之和達到了84%。其中PC1占主要貢獻值??赡芪镔|(zhì)的大多數(shù)物理差異均是PC1導致的[23],這為進一步的判別分析提供了基礎。

    注:a 檢測角度為30°;b 檢測角度為60°;c 檢測角度為90°。

    注:a為檢測角度為30°;b為檢測角度為60°;c為檢測角度為90°。

    2.3 判別分析結果

    花生油從不同檢測角度的3個判別模型結果如表2所示。當檢測角度為30°時,400~600 nm的預測集在判斷不超標樣本時正確率只達到81%,這可能是不超標樣本中AFB1含量太低,受花生油本身熒光影響大。另外,當研發(fā)的LIF檢測角度為60°時,在600~800 nm范圍建立模型的正確率整體要比其在400~600 nm建立模型的正確率高。盡管AFB1的熒光特征峰位于425~500 nm,但花生油在污染AFB1后光譜的差異性不僅是AFB1本身的差異性,還與樣品本身熒光物質(zhì)有關[24]。然而,當研發(fā)的LIF檢測角度為90°,建模波段為400~600 nm時,SVM模型的各個指標正確率均達到100%。由此可見,當熒光檢測角度為90°時,可最大程度地減少透射光與散射光的影響[25]。因此,在研發(fā)LIF系統(tǒng)用于檢測判別花生油中AFB1是否超標時,檢測角度設置為90°,結合SVM在400~600 nm建立的判別模型可展現(xiàn)更高的精度優(yōu)勢。

    表2 污染AFB1是否超標的花生油樣品判別分析模型

    2.4 花生油中AFB1含量的PLSR定量預測

    表3 花生油中AFB1含量PLSR模型預測分析結果

    3 結論

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