β-羥丁酸調(diào)控叉頭框蛋白O1促糖尿病大鼠肝糖原儲(chǔ)存的機(jī)制*

張伯寧， 李佳臨， 劉子敬， 劉 昆， 鄭 麗，3， 栗彥寧△， 齊錦生

（1河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，河北石家莊050017；2河北醫(yī)科大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050017；3邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺(tái)054000）

糖尿病是一種血糖水平慢性增高的代謝綜合征，可導(dǎo)致肝臟功能障礙，進(jìn)而加劇糖尿病代謝紊亂。肝臟作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝中心，而肝糖原作為血糖的直接來(lái)源，在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1-2］。肝糖原的合成與分解，處于嚴(yán)密而動(dòng)態(tài)的調(diào)控中，而糖尿病時(shí)，肝糖代謝紊亂，致肝糖原儲(chǔ)存減少，促使血糖升高［3］。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）是參與代謝調(diào)控的、高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，可在胞質(zhì)和胞核之間穿梭，從而發(fā)揮不同的作用［4］。糖尿病時(shí)，胰島素抵抗等因素致FoxO1功能紊亂，定位于核內(nèi)，加劇高血糖等代謝紊亂［4］。

酮體由β-羥丁酸（70%）、乙酰乙酸（30%）和丙酮（微量）組成，且前兩者之間可以相互轉(zhuǎn)變。目前研究顯示，酮體的主要組分，β-羥丁酸除提供能量外，還可作為生物活性小分子，發(fā)揮重要的保護(hù)作用［5］。雖然糖尿病酮癥時(shí)，過(guò)高濃度的酮體會(huì)造成昏迷等損傷作用，但10 mmol/L以下的生理濃度則發(fā)揮重要的抗氧化、抗炎等保護(hù)作用［6］。研究表明，β-羥丁酸可緩解糖尿病患者胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［7］。同時(shí)，β-羥丁酸可促進(jìn)老年大鼠FoxO1與PGC-1α的結(jié)合，起到緩解炎癥損傷的作用［8］。那么，β-羥丁酸是否能夠促使糖尿病大鼠肝FoxO1轉(zhuǎn)位出核，增加肝糖原的儲(chǔ)存呢？本項(xiàng)工作擬用糖尿病大鼠模型，研究β-羥丁酸調(diào)控FoxO1并影響肝糖原儲(chǔ)存的可能機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，8周齡，體重（249.95±24.11）g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)為No.1604165）。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)自Sigma，溶于pH 4.4枸櫞酸鹽緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用；β-羥丁酸鈉購(gòu)自Sigma，溶于生理鹽水；PAS染色液購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；FoxO1和β-actin抗體均購(gòu)自博奧森生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自北京中山生物科技公司；四甲基羅丹明異硫氰酸酯（tetramethyl?rhodamine isothiocyanate，TRITC）標(biāo)記的Ⅱ抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylin?dole，DAPI）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 糖尿病肝損傷模型的建立 大鼠隨機(jī)分為正常（control，Con）組（n=8）、糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）組（n=10）、β-羥丁酸1（β-hydroxybutyrate 1，B1）組（n=10）、β-羥丁酸2（B2）組（n=10）和β-羥丁酸3（B3）組（n=10）。DM組和β-羥丁酸干預(yù)各組大鼠腹腔注射STZ（40 mg·kg?1·d?1）。大鼠STZ注射3 d后，用羅氏血糖儀檢測(cè)空腹血糖水平，高于11.1 mmol/L即為糖尿病模型建立。B1組、B2組和B3組大鼠分別皮下注射β-羥丁酸鈉160、200和240 mg·kg?1·d?1，其它組大鼠注射等體積生理鹽水。糖尿病大鼠肝損傷模型制作及β-羥丁酸干預(yù)參考前期研究基礎(chǔ)［9-10］。β-羥丁酸鈉干預(yù)12周后，檢測(cè)大鼠的體重和血糖、肝臟組織病理學(xué)變化、肝糖原的含量、總的和胞核FoxO1蛋白含量及FoxO1的分布。

3.2 大鼠肝臟的組織病理學(xué)觀察 取肝臟組織，4%的多聚甲醛溶液固定6 h，用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級(jí)脫水，石蠟包埋，作3~5μm冠狀切片，HE染色，于顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

3.3 大鼠肝臟的糖原染色 石蠟切片脫蠟至水，切片入PAS染色液B中染色10~15 min，自來(lái)水洗，蒸餾水洗兩遍；切片入PAS染色液A浸染25~30 min，避光，流水沖洗5 min；切片入PAS染色液C染30 s，自來(lái)水洗，鹽酸水溶液分化，自來(lái)水洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。脫水封片后，于顯微鏡下觀察肝臟糖原的染色情況。

3.4 Western blot檢測(cè)FoxO1蛋白含量 肝臟組織液氮冷凍后勻漿，用RIPA裂解液提取總蛋白，同時(shí)試劑盒抽提細(xì)胞核蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取100μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉后，加入Ⅰ抗［anti-FoxO1（1∶200）或anti-β-actin（1∶2 000）］，4℃搖床過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶2 000）。顯色后，測(cè)量條帶的灰度值：計(jì)算總FoxO1與actin含量的比值，以反映總FoxO1的相對(duì)蛋白含量；計(jì)算胞核與總FoxO1蛋白含量的比值，以反映胞核FoxO1的相對(duì)蛋白含量。

3.5 免疫熒光染色顯示大鼠肝臟FoxO1分布 取肝臟組織冰凍切片后，4%多聚甲醛固定15 min，1%的TritonX-100室溫下處理30 min，10%山羊血清37℃封閉1 h。棄除封閉液，加入FoxO1抗體（1∶50），4℃孵育過(guò)夜。加入TRITC標(biāo)記Ⅱ抗（1∶50），避光37℃孵育1 h。加入細(xì)胞核染色液DAPI，避光室溫作用15 min。滴加適量的抗熒光衰減封片液（50%甘油），蓋玻片封片后，熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。FoxO1的染色為紅色，細(xì)胞核的染色為藍(lán)色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 β-羥丁酸對(duì)糖尿病大鼠體重和血糖的影響

各組間大鼠初始體重?zé)o顯著性差異；12周后，與Con組相比，DM組及β-羥丁酸干預(yù)各組大鼠體重均顯著降低（P<0.01），而DM組和β-羥丁酸干預(yù)各組之間大鼠體重?zé)o顯著差異。與Con組相比，DM組和β-羥丁酸干預(yù)各組初始血糖均顯著升高（P<0.01），提示糖尿病大鼠模型成功建立；12周后，與Con組相比，DM組及β-羥丁酸干預(yù)各組大鼠血糖仍顯著增高（P<0.01），而β-羥丁酸干預(yù)各組血糖比糖尿病組稍有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 大鼠體重和血糖的變化Table 1.Changes in body weight and blood glucose of rats（Mean±SD.n=8）

2 β-羥丁酸對(duì)糖尿病大鼠肝臟形態(tài)學(xué)及糖原含量的影響

HE染色觀察可見，Con組肝小葉結(jié)構(gòu)完好，肝細(xì)胞索排列整齊，未見病理?yè)p傷；而DM組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪空泡和脂滴；B1組肝小葉結(jié)構(gòu)損傷與糖尿病組相似，而B2組和B3組肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完好，細(xì)胞內(nèi)有少量脂肪空泡及脂滴，見圖1。同時(shí)，大鼠肝臟組織的糖原染色顯示，Con組肝糖原深染成紫色；而DM組糖原染色極淺；β-羥丁酸干預(yù)各組糖原染色強(qiáng)度依次增加，以B2組和B3組染色加深更為明顯，見圖2。

3 β-羥丁酸減少糖尿病大鼠肝細(xì)胞核內(nèi)FoxO1蛋白含量

12周后，與Con組相比，DM組總的及胞核FoxO1相對(duì)蛋白含量顯著增多（P<0.05）；而與DM組相比，β-羥丁酸干預(yù)各組總的FoxO1相對(duì)蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胞核FoxO1相對(duì)蛋白含量在B2組和B3組顯著降低（P<0.05），見圖3。

4 β-羥丁酸抑制糖尿病大鼠肝FoxO1核轉(zhuǎn)位

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Con組FoxO1熒光（紅色）幾乎均分布于胞漿，與胞核的染色（藍(lán)色）無(wú)重疊；而DM組可見FoxO1熒光增強(qiáng)，并明顯積聚在核內(nèi)，與胞核的染色疊加呈明顯的粉紫色；β-羥丁酸干預(yù)各組胞核內(nèi)FoxO1熒光減弱，以B2組和B3組最為明顯，見圖4。

討 論

糖尿病是以一種高血糖為主的代謝紊亂綜合征。糖尿病時(shí)，代謝紊亂可引起肝細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致肝臟功能障礙［3，11］。而肝臟作為糖、脂等代謝的中心，其功能障礙又會(huì)加劇糖尿病代謝紊亂［3］。肝糖原作為糖的直接來(lái)源，其合成和分解受到嚴(yán)格的調(diào)控，以參與維持血糖穩(wěn)態(tài)。糖尿病時(shí)，肝糖原合成與分解的不平衡是促使血糖升高的因素［3］。

我們前期的研究證實(shí)，STZ制作糖尿病大鼠模型10周以上，可造成明顯的肝臟損傷［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病大鼠12周時(shí)，血糖顯著升高，體重顯著降低，提示糖尿病大鼠模型的穩(wěn)定建立。肝臟組織形態(tài)學(xué)檢查顯示，糖尿病大鼠肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)含有大量脂滴和脂肪空泡，提示糖尿病肝臟損傷。進(jìn)而，肝臟組織糖原染色顯示，糖尿病大鼠肝糖原含量極度減少，提示其肝糖原代謝紊亂，致肝糖原儲(chǔ)存耗竭。

Figure 1.HE staining of rat liver（scale bar=50μm）.A：Con group；B：DM group；C：B1 group；D：B2 group；E：B3 group.In?tact liver structure was seen in Con group，but liver structure was disordered with lipid droplets in DM group.The injured liver structure was attenuated obviously in B2 and B3 groups.圖1 大鼠肝臟的HE染色

Figure 2.Glycogen staining of rat liver（scale bar=50μm）.A：Con group；B：DM group；C：B1 group；D：B2 group；E：B3 group.Although deep glycogen staining was seen in Con group，it was hardly seen in DM group.The intensity of glycogen staining increased afterβ-hydroxybutyrate intervention，especially in B2 and B3 groups.圖2 大鼠肝臟的糖原染色

糖供應(yīng)不足時(shí)產(chǎn)生的酮體小分子β-羥丁酸，在其生理劑量，除供能外，還對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)揮重要的保護(hù)作用［6，12］。有報(bào)道，β-羥丁酸可緩解糖尿病患者胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［7］。我們前期的研究表明，β-羥丁酸通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗纖維化等，對(duì)糖尿病大鼠的心血管損傷，發(fā)揮重要的保護(hù)作用［10，13］。本研究顯示，中劑量和高劑量的β-羥丁酸干預(yù)可明顯改善糖尿病大鼠肝組織細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝糖原儲(chǔ)存，提示了其對(duì)糖尿病大鼠肝損傷和糖原耗竭的抵抗作用。然而，前期及本實(shí)驗(yàn)均未顯示，β-羥丁酸對(duì)糖尿病大鼠血糖的顯著降低作用，這可能也和STZ造成大鼠胰島的損傷有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄因子FoxO1作為胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子，調(diào)控糖代謝的不同途徑，如糖酵解、糖異生等，維持肝內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)［14-15］。當(dāng)胰島素與其受體結(jié)合后，可引起FoxO1的磷酸化，使其定位于胞漿，促進(jìn)糖酵解、糖原合成等，使肝糖生成減少。而糖尿病胰島素抵抗等病理情況下，F(xiàn)oxO1不能被磷酸化，從而激活入核，作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)糖異生等相關(guān)基因的表達(dá)，使肝糖生成增多［4］。有報(bào)道，糖尿病小鼠FoxO1存在定位功能紊亂，致糖原儲(chǔ)存減少、高血糖等病理狀態(tài)［14，16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，糖尿病大鼠肝總的及核內(nèi)FoxO1蛋白含量顯著增多，F(xiàn)oxO1明顯轉(zhuǎn)位入核，與研究報(bào)道相一致。而如何促使FoxO1出核，增加肝糖原儲(chǔ)存，緩解糖尿病高血糖，也成為了研究焦點(diǎn)［17］。

Figure 3.Total and nuclear protein levels of FoxO1 in rat liver tissues detected by Western blot.Compared with Con group，total and nuclear FoxO1 protein levels increased in DM group，and the increased nuclear FoxO1 protein level was significantly re?duced in B2 and B3 groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Con group；#P<0.05 vs DMgroup.圖3 大鼠肝組織總的和胞核FoxO1蛋白水平

Figure 4.Distribution of FoxO1 in rat liver（scale bar=50μm）.A：Con group；B：DM group；C：B1 group；D：B2 group；E：B3 group.Although FoxO1 was located in the cytoplasm in Con group，it increased and concentrated in the nucleus in DM group.The nuclear FoxO1 fluorescence weakened afterβ-hydroxybutyrate intervention，especially in B2 and B3 groups.圖4 大鼠肝FoxO1的分布

代謝核心調(diào)控因子FoxO1與β-羥丁酸之間存在緊 密 聯(lián) 系［8，18］。 已 知 β-羥 丁 酸 可 促 進(jìn) 老 年 大 鼠FoxO1與PGC-1α的結(jié)合，起到緩解腎臟炎癥損傷的作用［8］。Miyauchi等［18］報(bào)道，β-羥丁酸可上調(diào)FoxO1的表達(dá)，緩解小鼠缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肝臟炎癥。本研究結(jié)果提示，中劑量和高劑量的β-羥丁酸干預(yù)可顯著減少糖尿病大鼠肝細(xì)胞核FoxO1的蛋白含量，抑制其核轉(zhuǎn)位，增加肝糖原儲(chǔ)存。然而，β-羥丁酸是否及如何影響糖尿病大鼠肝FoxO1的磷酸化等修飾，促使其轉(zhuǎn)位出核，從而發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，β-羥丁酸干預(yù)能減輕糖尿病大鼠肝臟病理?yè)p傷，增加肝糖原儲(chǔ)存，其機(jī)制可能與β-羥丁酸抑制高糖刺激的FoxO1核轉(zhuǎn)位有關(guān)。而除了FoxO1相關(guān)因素，β-羥丁酸的肝臟保護(hù)作用是否還有其它機(jī)制參與，仍需研究。