Nrf2在腦鐵代謝中作用的研究進展*

高雅萱， 宋順晨， 盛 奕， 芮同宇， 羅承良

（蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院法醫(yī)學系，江蘇蘇州215123）

神經細胞的鐵代謝平衡對大腦的正常功能至關重要。很多腦部疾病常常伴隨有腦鐵代謝（brain iron metabolism）的紊亂。這種紊亂不加控制可以引起神經細胞的鐵死亡（ferroptosis）——一種可調控性細胞死亡（regulated cell death，RCD）形式，其特征是鐵過載引起的脂質過氧化（lipid peroxidation，LPO）積累。作為一種轉錄因子，核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）調控許多與腦鐵代謝和鐵死亡相關的基因。研究顯示，Nrf2起到了減輕“有毒”鐵負載、緩解鐵死亡的作用。本文根據此方面的研究進展，從神經細胞吸收、儲存、利用、釋放鐵和抗鐵死亡的角度對Nrf2調控腦鐵代謝紊亂進行了總結。

1 腦鐵代謝及腦鐵代謝紊亂所致疾病

在生命體內，鐵幾乎是所有真核細胞必需的金屬元素［1］。鐵參與眾多氧化還原反應、電子傳遞及合成反應，也是各種酶的重要輔助因子［2-3］。鐵擁有不成對電子，可接受或提供電子，從而表現(xiàn)出靈活的配位和氧化還原活性。在生理情況下，通過細胞多步調控，游離的不穩(wěn)定鐵被轉化成穩(wěn)定的價態(tài)后被收集、儲存或排出，幫助神經系統(tǒng)循環(huán)利用鐵元素。但在病理情況下，價態(tài)切換的延遲和鐵運輸?shù)奈蓙y會導致部分游離鐵從這樣的平衡中“逃逸”出來，從而產生毒害效應。神經細胞的游離鐵超載常表現(xiàn)為細胞代謝異?；蚣毎劳?，這樣的鐵被稱為“有毒”鐵。目前較多的解釋是“有毒”鐵通過芬頓（Fenton）反應（工業(yè)上處理廢水的核心反應）產生高度活化的自由基（free radical），即以Fe2++H2O2=Fe3+·OH+OH?為核心（由于濃度、pH值等問題未能在體內直接證明［4］，但有大量可靠的間接證據［5］），產生過多的以羥自由基（·OH）為主的自由基團；這些物質會引起生物膜的LPO，破壞以多不飽和脂肪酸、磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸為主的細胞膜脂質結構，而他們是腦神經細胞重要的基本組成物質。嚴重的鐵代謝紊亂會導致神經細胞的鐵死亡，引起不同程度的腦功能異常［6］。值得注意的是，上述鐵紊亂和LPO的修復過程均有Nrf2參與調控。

腦部疾病是人類致殘和死亡的主要原因之一。腦鐵代謝紊亂在多種腦部疾病中均有體現(xiàn)，其中在神經退行性疾病中最多：有學者提出“金屬假說”，即包括帕金森病（Parkinson disease，PD）［7］、阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）［8］、亨廷頓舞蹈?。℉un?tington disease，HD）［9］、肌萎縮性側索硬化（amyo?trophic lateral sclerosis，ALS）［10］等在內的神經退行性疾病存在以腦鐵為代表的金屬元素紊亂；其次，以腦出血為特征的腦損傷性疾病如創(chuàng)傷性腦損傷［11］、出血性腦卒中［12］等，由于血液中含有的鐵大量進入腦組織，會造成神經細胞鐵代謝異常和氧化應激；此外，原發(fā)性腦腫瘤［13］、癲癇［14］、多發(fā)性硬化癥［15］、抑郁癥［16］、精神分裂癥［17］等也均發(fā)現(xiàn)有不同程度的腦鐵沉積。總之，上述研究提供了各種腦疾病中存在鐵代謝紊亂的充分證據?；诖?，Nrf2作為一個潛在的調節(jié)鐵代謝和鐵死亡的關鍵轉錄因子，引起了大家的關注。

2 Nrf2的結構及基本功能

Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zip?per，bZIP）轉錄因子，可與細胞核內小Maf蛋白特異性結合，共同調節(jié)1 000多種基因。正常情況下，Nrf2在胞質內結合于它的負性調節(jié)分子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated pro?tein 1，Keap1）后被泛素化標記，Nrf2-Keap1復合物沿著肌動蛋白移動，被運輸?shù)?6S蛋白酶體降解，從而將神經細胞胞質中的Nrf2維持在低水平。但當細胞受到大量應激時，Keap1結構上的半胱氨酸殘基就結合胞內的親電試劑，從而導致Keap1構象的改變，引起Nrf2與Keap1解離，Nrf2轉移入核。在細胞核內，Nrf2與小Maf蛋白結合后小Maf蛋白被誘導，與靶基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應元件（antioxidant re?sponse element，ARE）相互作用，促進相關基因的轉錄（圖1）。

Figure 1.The structure and schematic diagram of Keap1-Nrf2.Under unstressed conditions，Keap1 facilitates Nrf2 ubiquitylation，and then Nrf2 is degraded by 26Sprotease.Under conditions of oxidative or electrophilic stress，cysteine（Cys）residues on Keap1 are modified to prevent Nrf2 from degradation，and then Nrf2 accumulates and translocates to the nucleus where it is combined with the small Maf protein to promote the transcription of target genes.圖1 Keap1-Nrf2結構及功能示意圖

3 Nrf2在腦鐵代謝中的作用及機制

研究發(fā)現(xiàn)，腦部疾病常常伴有鐵代謝異常［18］和Nrf2含量的改變［19］。以往認為Nrf2僅參與神經細胞的抗氧化和抗炎反應，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)它也調控眾多腦鐵相關蛋白的代謝活動，包括轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）、鐵蛋白（ferritin）、鐵轉運蛋白（fer?roportin，F(xiàn)pn）、亞鐵螯合酶（ferrochelatase，F(xiàn)ECH）、ATP-binding cassette subfamily Bmember 6（ABCB6）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成的關鍵酶、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、硫氧還蛋白（thioredoxin，TXN）系統(tǒng)的酶、LPO解毒酶等，他們起到了減輕神經細胞鐵負荷、緩解鐵死亡進程的作用。筆者總結了Nrf2對腦鐵代謝的研究，發(fā)現(xiàn)無論是胞內還是胞外，未能有效、及時地清理容易引起芬頓反應的“有毒”鐵是腦鐵代謝紊亂的直接原因。Nrf2一方面通過加速胞外、胞內“有毒”鐵的轉化和代謝，另一方面又輔助清除由鐵紊亂引起的過氧化堆積物，從而維持腦鐵的內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。下文將詳述Nrf2如何調控腦鐵代謝。

3.1 Nrf2促進腦鐵攝入 Nrf2-ARE通過促進血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）和神經細胞膜上TfR1的轉錄，加強了腦鐵代謝中鐵的攝入，降低細胞外游離鐵的危害。一般認為在生理情況下，腦中主要通過轉鐵蛋白（trransferrin，Tf）與TfR1結合吸收鐵。Tf是一種具有2個Fe3+高親和力位點的糖蛋白，接受循環(huán)系統(tǒng)中的鐵［20］，TfR1是它的受體（圖2）。TfR1在腦內廣泛分布，尤其在BBB上高表達，在生理情況下TfR1是鐵入腦的最主要通道。具有缺乏TfR1多巴胺（dopamine，DA）能神經元的小鼠出現(xiàn)了嚴重的神經元鐵不足、進行性退行性變、運動活性下降及早期死亡的表現(xiàn)［21］。TfR1不僅在轉錄階段受到Nrf2的作用［22］，在翻譯階段，鐵調節(jié)蛋白（iron regulatory pro?teins，IRPs）能結合TfR1的mRNA上3'端非翻譯區(qū)，阻止其降解［23］。一方面，從Tf上脫下的Fe3+在復雜的內吞作用后改變價態(tài)［24］，以Fe2+的形式大部分進入線粒體被利用，其余的可進入鐵蛋白儲存，或通過Fpn輸出細胞；另一方面，TfR1-Tf復合物返回細胞膜［25］后二者分開，再次進入鐵循環(huán)使用（圖2）。

Figure 2.Diagram of iron metabolism in blood-brain barrier（BBB）regulated by Nrf2.Top left shows the loop of Tf-Fe-TfR1，the main iron absorption way in BBB.Tf-Fe3+combines with TfR1.Tf-Fe3+-TfR1 is freed and iron is exported into the cytoplasm by endocytic vesicle after reduction of the iron.A sea of Fe2+ions enter into mitochondria，while some either enter into LIP（iron in pool）or are released by Fpn.Lower left shows that cellular iron efflux is mediated by Fpn and requires iron oxida?tion（ceruloplasmin，hephaestin or hephaestin-like 1/zyklopen）on the extracellular side.Fpn is negatively regulated by the ubiquitination marker of hepcidin produced by liver.Top right shows EPO-EPOR-dependent phases of brain cells.The cen?ter of the figure depicts the way how ferritin stores and releases iron.Some iron is taken by LIP.All red markers are regu?lated by Nrf2.圖2 Nrf2促進腦鐵攝入及代謝的示意圖

3.2 Nrf2促進腦鐵儲存 Nrf2上調鐵蛋白的表達，保證了神經細胞能儲存大量穩(wěn)定的鐵，減少不穩(wěn)定游離鐵的含量。神經細胞發(fā)展出一套系統(tǒng)用于儲存那些暫不需要立即參加代謝活動的鐵，這套系統(tǒng)主要靠的是一種緩沖物質——鐵蛋白的作用。鐵蛋白在生物中廣泛存在，進化上高度保守［26］。鐵蛋白是細胞內的主要儲鐵蛋白，有重鏈（H-ferritin，F(xiàn)TH1）和輕鏈（L-ferritin，F(xiàn)TL）共24條：FTH1具有鐵氧化酶（ferroxidase）的活性，可以催化Fe2+到Fe3+［27］；FTL則起到了促進鐵儲存的作用。在FTH1和FTL的共同作用下，鐵蛋白能儲存多達4 500個鐵原子［28］。在神經細胞內，F(xiàn)TH1和FTL基因的上游均有ARE序列，可被Nrf2結合，發(fā)揮調控作用［29］。與TfR1一樣，鐵蛋白在mRNA水平也有IRPs的參與。鐵蛋白對腦鐵的調控至關重要，F(xiàn)TL的C端移碼突變會導致腦內罕見的神經鐵蛋白病變（neuroferritinopathy）［30］。研究發(fā)現(xiàn)AD、ALS和PD患者的鐵蛋白含量異常升高［31］，這可能是疾病引起腦鐵紊亂后細胞用以緩沖鐵超載的一種方式。

3.3 Nrf2減少神經細胞線粒體內游離鐵含量 Nrf2通過原卟啉IX（protoporphyrin IX，PPIX）間接穩(wěn)定線粒體內游離鐵的含量，同時產生多種酶促反應所需的血紅素。鐵、線粒體與Nrf2的關系密切，其中線粒體是鐵含量最高的細胞器。線粒體被認為是鐵參與血紅素合成的“化工廠”，因為血紅素的合成完全依賴于線粒體。線粒體外膜的ABCB6和內膜的FECH都受到Nrf2的正調控，共同負責血紅素在線粒體內最后階段的合成。ABCB6把糞卟啉原III（copro?porphyrinogen III）從細胞質輸入線粒體［32］，糞卟啉原III在線粒體內發(fā)生氧化脫羧、脫氫等反應后形成PPIX；FECH本身也是含有鐵硫簇的酶［33］，可將Fe2+插入到PPIX中，最終生成的血紅素在相應膜受體蛋白的幫助下運出線粒體（圖2）。一方面，血紅素作為眾多氧化還原反應酶的重要組成，維持了腦細胞的正常生化代謝，另一方面，Nrf2借助PPIX螯合了過量的鐵，減輕了線粒體鐵負載。在體內、體外的PD模型中，tricetin作為Keap1-Nrf2的競爭抑制劑，可以誘導神經細胞Nrf2的累積，提高血紅素的含量，起到一定的神經保護作用［34］。

3.4 Nrf2調控腦鐵運出 在神經系統(tǒng)內，Nrf2調控著唯一能輸出鐵的蛋白——Fpn。Fpn是目前已知的唯一腦細胞輸出鐵的蛋白，在哺乳動物中高度保守［35］。星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元均表達Fpn［35］。生物計算模擬出了BbFpn（Fpn的細菌同源物）的結構，其晶體結構表明Fpn有兩瓣［36］，中間形成一個空腔，含有鐵結合位點。根據兩個瓣的空間組織，中央空腔面向細胞內時接受細胞內的Fe2+，當向 細 胞 外 開 放 時 釋 放Fe2+［37］。 大 腦BBB［38］和 脈 絡叢［39］的鐵輸出也主要依靠Fpn［40］。Fpn把胞內的Fe2+運出后，F(xiàn)e2+被3種不同的氧化酶——銅藍蛋白（ce?ruloplasmin，CP）、hephaestin（HEPH）和zyklopen（hephaestin-like 1，HEPHL1）氧化為穩(wěn)定的Fe3+（圖2）。Fpn基因啟動子序列中包含ARE，可以結合Nrf2。Nrf2的激活劑diethyl malate和sulforaphane可以上調小鼠巨噬細胞中Fpn的mRNA水平［41］。同樣的，F(xiàn)pn的mRNA在非翻譯區(qū)含有5'的鐵反應元件（iron response element，IRE），在缺鐵條件下，IRE與IRPs結合，起到了抑制翻譯的作用［42］。值得注意的是，F(xiàn)pn還受到鐵調素（hepcidin）的調控，后者通過介導泛素化途徑降解Fpn［42］，在非腦組織尤其是肝臟中，鐵調素的合成與Nrf2關系密切（圖2），但鐵調素在腦內是否受到Nrf2調控還有待進一步研究。

3.5 Nrf2抑制神經細胞鐵死亡引起的過氧化 胞內抗LPO的主要物質GSH-GPX4抗LPO軸的關鍵合成酶的基因都受到Nrf2的正向調控；同時，Nrf2可通過上調TXN系統(tǒng)來代償GSH系統(tǒng)；并且許多針對鐵死亡后過氧化下游產物的解毒酶也被Nrf2激活。上文提及，通過芬頓反應，持久的腦鐵負荷會加重神經細胞的LPO累積，引起鐵死亡。星形膠質細胞通過Nrf2來介導細胞抗過氧化物和抗氧化應激。以往大量研究表明，GSH-GPX4抗LPO軸是抵抗鐵死亡的重要組成［43］，而Nrf2是促進GSH生物合成關鍵酶（谷氨酸-半胱氨酸連接酶、GSH合成酶和SLC7A11）、還原氧化型GSH的酶（GSH還原酶）以及抗LPO關鍵酶GPX4［44］的基因轉錄［45］的重要因子。在缺血性腦損傷中，外源性褪黑素通過增加Nrf2-GPX4，可以減少神經細胞鐵死亡，明顯改善大鼠學習、記憶和認知能力。近期研究發(fā)現(xiàn)，TXN系統(tǒng)是防御氧化應激的關鍵抗氧化系統(tǒng)［46］，由NADPH、TXN還原酶和TXN組成，在GSH系統(tǒng)受損或失活時TXN可能起到了抗氧化的代償作用。在TXN系統(tǒng)中的TXN1和TXNRD1作為Nrf2的靶基因與鐵死亡的關聯(lián)已經有文獻報道［47］。Nrf2還調控LPO下游產物的解毒過程［48］，比如醛酮還原酶家族（AKR1C1-3）家族和乙醛脫氫酶家族（ALDH3A1）［49］等，在一定程度上能對抗神經細胞鐵死亡對周圍組織的毒副作用。

4 小結與展望

盡管鐵代謝相關腦疾病的臨床治療和預后一直是醫(yī)學界的難題，但是對Nrf2在腦鐵代謝中的研究，依然可以為腦疾病的治療提供一些借鑒，而且Nrf2對緩解神經細胞鐵死亡也有直觀的作用。雖然Nrf2在腦鐵代謝紊亂中的作用已經被逐步認識，但還有許多問題亟待解決：一方面，Nrf2在基因轉錄層面指導蛋白質的從頭合成，雖然作用持久，但短期內不一定能起到及時的治療效果，同時部分腦鐵代謝相關蛋白的翻譯還會受到IRPs調控；另一方面，腦內其他一些不受Nrf2調控的蛋白，如乳鐵蛋白（lactofer?rin）［49］、TfR2等，常在腦疾病的中后期被異常激活，這會加速腦鐵代謝紊亂。由此可見，Nrf2可能適用于腦鐵紊亂的早期預防和前期治療，對于中晚期腦疾病并不一定有效。此外，關于Nrf2的用藥：由于Nrf2激活劑靶點較多且難入BBB，常會對機體產生較大的副作用；通過刺激腦內特定靶點，如促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）和相應受體EPOR，可激活腦細胞自主分泌Nrf2［50-51（］圖2）；也有用納米載體、單克隆抗體、脂質體等靶向作用于TfR而載藥入BBB［52］。但總體而言，Nrf2治療腦代謝鐵紊亂還處在試驗階段，在臨床治療上運用較少。我們對Nrf2認識的不斷深入必將為腦鐵代謝紊亂性疾病的治療提供有效的策略。