腫瘤外泌體促進高糖難愈創(chuàng)面的愈合*

張 超， 李晨輝， 王曉林， 陳層層， 馬家豪， 孫彤彤， 賈增宇， 南文濱

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院納米生物醫(yī)用材料研究中心，河南新鄉(xiāng)453003）

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，受到多種因素的影響，包括細胞遷移、增殖和血管生成等［1-2］。慢性頑固性創(chuàng)面可由多種因素引起，如高齡、營養(yǎng)不良、糖尿病、感染、壓力和藥物治療［3-4］。糖尿病足潰瘍引起的截肢和死亡率在逐年上升。糖尿病傷口的病因包括高血糖引起的內(nèi)皮功能障礙和血管生長受到抑制［5］，以及成纖維細胞增殖和遷移減少等［6］。而成熟的血管網(wǎng)絡(luò)需要細胞遷移和增殖、膠原合成和沉積的協(xié)調(diào)統(tǒng)一［7］。因此，增加創(chuàng)面部位新生血管的形成有利于傷口部位的細胞遷移、增殖和膠原沉積，從而加速糖尿病傷口的愈合。

外泌體（exosomes）是細胞分泌的一種直徑約為40~150 nm的囊泡，能通過將原細胞內(nèi)含的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細胞的方式參與細胞交流。近年來多項研究表明，腫瘤細胞分泌的外泌體（即腫瘤來源的細胞外囊泡，tumor-derived extracel?lular vesicles，tEVs）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。有研究指出膠質(zhì)母細胞瘤分泌的外泌體可以促進內(nèi)皮細胞的增殖，而且含有豐富的血管生成相關(guān)蛋白，能有效促進新生血管生成；黑色素瘤來源的外泌體中也含有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）等血管生成相關(guān)蛋白［8-9］?；诖?，我們設(shè)想將tEVs的這些調(diào)控功能應(yīng)用于皮膚組織缺損的修復(fù)過程，希望其也能發(fā)揮相關(guān)的調(diào)控作用，并進一步促進皮膚組織修復(fù)。本研究以此為切入點，評價小鼠乳腺癌4T1細胞分泌的外泌體對糖尿病小鼠難愈創(chuàng)面愈合過程的影響，探討其作用機制及應(yīng)用潛能。

材料和方法

1 動物

本研究所用動物為C57BL/6（C57）雄性小鼠，6~7周齡，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK（豫）2020-0005。小鼠乳腺癌4T1細胞、小鼠成纖維細胞系L929和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

2 主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、BCA蛋白檢測試劑盒、蘇木精-伊紅（he?matoxylin-eosin，HE）染色液、抗CD9抗體、抗TSG101抗體和抗CD31抗體購自Servicebio；胎牛血清購自Scitecher；無外泌體血清購自SBI；鏈脲佐菌素（strep?tozocin，STZ）購自源葉生物科技公司；Matrigel購自BD。透射電子顯微鏡購自Hitachi；低溫高速離心機和多功能酶標儀購自Thermo；超高速離心機購自Beckman Coulter；血糖儀購自Roche。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng) 4T1細胞在含10%無外泌體血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。L929細胞用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中均含有1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。

3.2 細胞外泌體的分離及鑒定 采用超速離心法分離tEVs。將4T1細胞上清液于300×g、4℃離心10 min，棄去細胞沉淀，保留上清液；然后2 000×g、4℃離心10 min，保留上清液；10 000×g、4℃離心10 min，保留上清液；再用0.22μm濾膜過濾，然后將上清液轉(zhuǎn)移到超高速離心管中，140 000×g、4℃離心120 min，去掉上清液后用4℃的PBS重懸沉淀，140 000×g、4℃離心120 min，去掉上清液，最后用50μL的PBS重懸沉淀，?80℃保存?zhèn)溆?。用透射電鏡檢測tEVs的形態(tài)及分布；Western blot檢測tEVs相關(guān)蛋白的表達。

3.3 CCK-8法檢測tEVs對L929細胞活力的影響將L929細胞按每孔2×103個接種到96孔板中，每孔加90μL無血清培養(yǎng)液。實驗組加入10μL濃度為100 mg/L的外泌體；對照組加入等體積的PBS；沒有細胞的一組作為空白組，每孔只加100μL無血清培養(yǎng)液。每組做5個復(fù)孔。培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后，分別向每孔中加入100μL含10%CCK-8的培養(yǎng)液，將孔板放入培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）并計算出每組的平均值。

3.4 劃痕法檢測tEVs對L929細胞遷移能力的影響 將處于對數(shù)生長期的L929細胞以2×108L?1的密度接種于6孔板，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當融合度達到80%以上時，用200μL的槍頭輕輕在孔板底部均勻劃一道痕跡，PBS清洗滑脫的細胞，再加入含有tEVs（100 mg/L）和PBS的2 mL無血清培養(yǎng)基與之共培養(yǎng)。在第0、6和24 h時進行拍照，每組做3個復(fù)孔。

3.4 Matrigel實驗檢測HUVEC小管形成 96孔板中加入60μL左右Matrigel充分搖勻，37℃孵育60 min使Matrigel充分凝固。實驗組向Matrigel包被過的孔板中加入100μL tEVs（100 mg/L）和HUVECs混合的細胞懸液，每孔約（1~2）×104個細胞，對照組加入等體積的PBS。8 h后顯微鏡下觀察成管情況，通過Image-Pro Plus 6.0軟件計算形成總分支點和總管數(shù)來判斷tEVs促進HUVECs成管的能力。

3.5 小鼠高血糖難愈創(chuàng)面模型的建立及治療 本實驗使用6周齡雄性C57小鼠20只，體重約為18~22 g。小鼠腹腔注射STZ（55 mg/kg），連續(xù)注射5 d，注射前一天晚上，小鼠禁食不禁水；注射當天開始，小鼠改為高糖高脂飲食并持續(xù)到實驗結(jié)束。STZ誘導(dǎo)3 d后檢測血糖水平，當血糖水平高于16.67 mmol/L時，視為成功的高血糖動物模型。將STZ誘導(dǎo)成功的小鼠用4%水合氯醛麻醉，用脫毛膏給小鼠背部皮膚脫毛，之后用無菌手術(shù)剪在小鼠背部剪切出均勻的直徑約為0.7 cm的全層皮膚創(chuàng)面。將小鼠分為：（1）tEVs組：在第0、3和6天時，向高糖小鼠創(chuàng)面四周皮下注射0.2 mL含100μg tEVs的PBS；（2）對照組（PBS組）：在同樣的時點向高糖小鼠創(chuàng)面四周皮下注射0.2 mL的PBS。在創(chuàng)面建立的第1、7、18和25天，拍照并記錄小鼠創(chuàng)面的愈合情況。在第7和14天時取小鼠新生皮膚用于后續(xù)實驗的研究。

3.6 組織學(xué)和免疫熒光分析 在第7和14天每組取3只小鼠，頸椎脫臼處死后取小鼠創(chuàng)面組織，4%的多聚甲醛固定，分別用70%、80%和90%的乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4~7μm厚的切片進行HE染色，評估傷口愈合情況；CD31進行免疫熒光染色，觀察各組的血管生成情況。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 tEVs的觀測及鑒定

利用透射電鏡觀察tEVs，如圖1A所示，4T1細胞的外泌體呈圓環(huán)的雙層膜囊泡，直徑在70 nm左右。Western blot檢測結(jié)果如圖1B所示，外泌體表達標志物CD9和TSG101。

Figure 1.Identification and characterization of exosomes.A：transmission electron microscopic observation of exo?somes（×40 000，scale bar=200 nm）；B：Western blot was used to detect the marker proteinsof exosomes.圖1 外泌體的鑒定及表征

2 tEVs對L929細胞活力和遷移能力的影響

分別采用CCK-8法和劃痕實驗檢測tEVs對L929細胞活力和遷移能力的影響。結(jié)果顯示，從第2天開始tEVs處理組的L929細胞活力均顯著高于對照組（P<0.05），見圖2A。在tEVs處理24 h后，L929細胞的遷移率明顯高于對照組（P<0.05），見圖2B。

3 tEVs在體外促進HUVECs小管生成

體外Matrigel小管形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，tEVs組生成了更多的管腔結(jié)構(gòu)，見圖3A。定量分析顯示，與對照組相比，tEVs組有更多的小管分支點和管腔數(shù)，以及更長的小管長度（P<0.05），見圖3B。

4 tEVs促進創(chuàng)面愈合

如圖4所示，在愈合前期，創(chuàng)面皮膚組織結(jié)痂，瘢痕攣縮明顯；第18天時，對照組創(chuàng)面仍處于愈合期，而tEVs處理組創(chuàng)面基本愈合，且結(jié)痂自然脫落；至第25天時，對照組創(chuàng)面結(jié)痂自然脫落，但創(chuàng)面新生組織仍不完整，而tEVs組創(chuàng)面已基本完全愈合，且可見新生毛發(fā)。

5 皮膚組織HE染色結(jié)果

對第7和14天小鼠創(chuàng)面全層皮膚組織進行HE染色的結(jié)果顯示，7 d時對照組和tEVs組創(chuàng)面均被新生皮膚組織覆蓋，但2組新生皮膚組織均主要為表皮層，且厚度較??；14 d時，對照組基底層厚度有所增加，但新生皮膚組織結(jié)構(gòu)單一仍不完善，而tEVs組創(chuàng)面上皮化程度高，覆蓋物與創(chuàng)面邊緣融合較好，基底層厚度明顯大于對照組，且可見棘層、顆粒層等結(jié)構(gòu)，新生表皮下膠原分布均勻，排列較整齊，與基底貼附緊密，創(chuàng)面愈合效果明顯優(yōu)于對照組，見圖5。

Figure 2.tEVs promoted the viability and migration of L929 cells.A：CCK-8 assay was used to test the viability of L929 cells treated with tEVs and PBS；B：the migration of L929 cells treated with tEVs or PBSwas observed by scratch assay（scale bar=200μm）.Mean±SD.n=5.*P<0.05，**P<0.01 vs PBSgroup.圖2 tEVs能增強L929細胞的活力和遷移能力

Figure 3.Effect of tEVs on tube formation of HUVECs.A：representative images of the tube formation of HUVECs treated with PBS or tEVs（scale bar=200μm）；B：quantitative analysis of the branch points，total loops，and total tube length in A.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs PBSgroup.圖3 tEVs對HUVECs成管的影響

6 創(chuàng)面愈合過程中細胞活力和血管再生的變化

組織免疫熒光檢測第7和14天時小鼠創(chuàng)面全層皮膚組織CD31的表達情況見圖6。結(jié)果顯示，CD31表達主要集中在新生皮膚組織基底層；第7天時tEVs組小鼠新生皮膚組織CD31表達明顯高于對照組；第14天時對照組CD31表達較第7天有所升高，2組小鼠新生皮膚組織基底層均有明顯CD31表達。

討 論

糖尿病創(chuàng)面作為一種慢性頑固性開放性傷口，在愈合過程中，由于創(chuàng)面處新生血管不足，不能為傷口周圍的細胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，細胞的增殖和遷移變得緩慢，這是導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩的主要方面之一，多項研究表明糖尿病患者的傷口難以愈合，與血管生成障礙、成纖維細胞的增殖和遷移以及膠原形成密切相關(guān)［10］。因此著眼于促進組織細胞增殖和遷移以及血管生成是解決高血糖難愈創(chuàng)面的有效途徑。我們同時關(guān)注到，腫瘤細胞來源的外泌體在血管生成及細胞增殖和遷移方面發(fā)揮著重要作用，而這些作用能有效促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［11-12］。那么，是否能夠利用腫瘤外泌體的相關(guān)調(diào)控功能，促進糖尿病難愈創(chuàng)面的修復(fù)呢？我們以此為切入點，在本文中評價4T1細胞分泌的外泌體對高糖難愈創(chuàng)面的修復(fù)效果，并探討其作用機制。

Figure 4.tEVs accelerated wound healing in diabetic mice.The gross healing images of mouse wounds treated with PBSor tEVs at 1，7，18 and 25 d.The diameter of the metal ring was 1.5 cm.圖4 tEVs促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合

Figure 5.Observation of HE staining of wound tissues at 7 and 14 d in tEVs group and control group.The scale bar=50μm.圖5 創(chuàng)面組織HE染色的觀察

Figure 6.Observation of CD31 immunofluorescence staining.The CD31 expression in wound tissues at 7 and 14 d in tEVs group and control group was observed by im?munofluorescence staining.The scale bar=100μm.圖6 CD31免疫熒光染色的觀察

首先，我們提取了tEVs，透射電鏡結(jié)果顯示tEVs呈圓環(huán)的雙層膜囊泡，且Western blot結(jié)果顯示其表達標志物CD9和TSG101，表明我們成功提取了4T1細胞的外泌體，可應(yīng)用于后續(xù)的研究；其次，在體外實驗中，我們用tEVs干預(yù)L929細胞和HUVECs，發(fā)現(xiàn)tEVs能有效促進成纖維細胞的活力和遷移能力且可以提高內(nèi)皮細胞成管的特性。Richards等［8］在一項研究中顯示，化療藥物gemcitabine可以促進腫瘤纖維母細胞分泌外泌體，而這些外泌體可進一步增強上皮細胞的活力并產(chǎn)生對gemcitabine的耐藥性。該結(jié)果與我們的結(jié)果類似，即腫瘤來源的外泌體可增強細胞的活力并促進其遷移，也同時提示了tEVs可能具有促進創(chuàng)面組織愈合的潛能；最后，在體內(nèi)實驗中，我們利用tEVs干預(yù)糖尿病小鼠創(chuàng)面的模型，結(jié)果證明tEVs可以加速高血糖難愈創(chuàng)面的愈合，并且tEVs跟對照組相比可以促進創(chuàng)面部位基底層的形成以及形成更完整的皮膚結(jié)構(gòu)。進一步的免疫熒光結(jié)果顯示，tEVs組小鼠新生皮膚組織CD31表達在第7天時明顯高于對照組，結(jié)合之前的體外實驗結(jié)果，我們認為tEVs可能調(diào)控了創(chuàng)面愈合早期血管生成的過程。最近也有相關(guān)研究展示了類似的結(jié)果，即腫瘤來源的外泌體可以促進腫瘤內(nèi)部血管生成［14-15］，而這也可能是我們實驗中，tEVs促進血管生成的潛在機制。

綜上所述，本研究證實了來源于腫瘤細胞4T1的外泌體可以有效促進糖尿病難愈創(chuàng)面的愈合，其潛在的機制可能與增強細胞活力和遷移能力及促進血管生成有關(guān)。該結(jié)果可為解決高血糖難愈創(chuàng)面的問題提供了一種新的思路。盡管我們目前尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤外泌體在用于組織修復(fù)過程中有任何“副作用”，但其安全性評價仍需進一步深入系統(tǒng)地探討，同時其促進難愈創(chuàng)面愈合的具體分子機制也是我們下階段研究的重點。