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      平喘顆粒對哮喘小鼠Ⅱ型固有淋巴細胞及巨噬細胞M2 型極化的影響

      2021-08-24 04:30:36袁星星田春燕李竹英
      海南醫(yī)學院學報 2021年16期
      關鍵詞:平喘肺泡氣道

      王 瑤,袁星星,田春燕,李竹英

      (1. 黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;3. 黑龍江省中醫(yī)藥科學院南崗分院,黑龍江哈爾濱 150006)

      哮喘是一種由多種炎癥細胞、結構細胞及細胞組份共同參與的慢性異質性疾病,以氣道炎癥、氣道高反應性和可逆性氣流受限為主要特征[1]。據(jù)調查結果顯示,全球每年因哮喘死亡的人數(shù)高達38萬,并且隨著工業(yè)化的發(fā)展和環(huán)境污染的加劇還在不斷增加,因此哮喘已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[2,3]。一項納入67 項橫斷面研究的薈萃分析結果顯示,我國成人哮喘的患病率為1.81%,并且呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[4]。因此,有效控制哮喘的發(fā)病對于提高哮喘患者生存質量和減輕社會經(jīng)濟負擔具有重要的意義。

      巨噬細胞作為抵御病原微生物入侵的第一道防線,能夠通過多種途徑在宿主防御、炎癥反應和組織修復中發(fā)揮重要的作用[5]。肺組織巨噬細胞是呼吸系統(tǒng)中重要的免疫細胞之一,通過極化成不同的表型從而參與炎癥的發(fā)生與控制[6]。Ⅱ型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2)是先天免疫系統(tǒng)中重要的效應細胞,有研究證實其能夠通過調控肺泡巨噬細胞的M2 型極化,從而促進肺上皮干細胞的增殖和分化和肺組織發(fā)育[7-9]。因此,本研究通過觀察哮喘小鼠肺組織中ILC2 和M2 型肺泡巨噬細胞數(shù)量的變化,從而進一步明確平喘顆粒抑制哮喘氣道炎癥、改善氣道重塑的作用機制。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物

      清潔級C57BL/6 小鼠(雌性,6~8 周齡),體質量18~20 g,購于北京Charles River 公司(實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2016-0011)。飼養(yǎng)條件:溫度:23℃~25℃,濕度:46%~56%,自由飲水、攝食,同時給予光照12 h。實驗過程嚴格遵循科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的有關規(guī)定[10]。

      1.2 藥物與試劑

      平喘顆粒(組成:淫羊藿、炙麻黃、太子參、黃芪、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼和知母按照4∶2∶3∶3∶3∶3∶2∶1∶2 的比例),實驗灌胃前制備成含藥量為1 080 g/L 的溶液;氫氧化鋁佐劑購于美國賽默飛公司(貨號:77161);卵清蛋白購于美國Sigma公司(貨號:A5253,純度:62%~88%);抗白介素33(interleukin 33,IL-33)、腫瘤發(fā)生抑制蛋白2(suppression of tumorigenicity 2,ST2)、Linage、干 細胞 抗 原1(stem cell antigen 1,SCA-1)、CD90.2、CD11b、F4/80、CD206 和 炎 癥 區(qū) 域(found in inflammatory zone 1,F(xiàn)IZZ1)抗體均購于美國Abcam 公 司(貨 號:ab187060、ab25877、ab93898、ab236486,ab269343,ab184307,ab16911,ab125028、ab271225);抗精氨酸酶-1(arginase-1,Arg1)、β-actin抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗均購于美國CST 公司(貨號:#13120、#93668、#4970、#7076);蘇木素伊紅染色試劑盒(Hematoxylin-Eosin,HE)、過碘酸-雪夫染色液試劑盒(periodic acid schiff,PAS)和Masson 三色染色試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司(貨號:G1120、G1281、G1340);小 鼠IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購于江蘇酶免實業(yè)有限公司(貨號:MM-0165M2、MM-0164M2、MM-0173M2MM-0935M2);SYBR Premix Ex Taq 試劑盒和轉錄試劑盒購于日本Takara 公司(貨號:RR420、639503)。

      1.3 方法

      1.3.1 分組與造模 小鼠按照體重隨機分為空白組、模型組、平喘顆粒組和IL-33 組,每組10 只。除空白組外,余下3 組小鼠參照課題組前期研究造模的方法構建哮喘小鼠模型[11],具體方法如下:分別于實驗的第1 天、第7 天和第14 天將含有2.5 mg 的氫氧化鋁佐劑和25 μg 的OVA 的生理鹽水250 μL腹腔注射,并于實驗的21~27 d 采用2%OVA 連續(xù)霧化激發(fā),1 次/d,每次30 min。而空白組小鼠則給予等劑量的生理鹽水腹腔注射和霧化替代致敏和激發(fā)。同時,分別于實驗的第1 天起,各組給予相應的藥物進行干預,其中平喘顆粒組給予31.2 g/kg 的平喘顆粒水溶液進行灌胃治療,IL-33 組于第1 天、第7 天 和 第14 天 致 敏 后1 h 給 予10 μg/kg 的IL33 中和抗體進行氣管滴注,而空白組和模型組小鼠則給予等體積的生理鹽水灌胃和氣管滴注替代治療,每日一次,連續(xù)治療14 d。各組小鼠于末次霧化激發(fā)后24 h,以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉后收集肺泡灌洗和肺組織用于指標檢測。

      1.3.2 肺組織病理學 取右肺組織固定于10%甲醛中,24 h 后乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后制備切片。按照染色試劑盒說明書分別進行HE、PAS 和Masson 染色,并在光鏡下觀察肺組織病理學改變。參照文獻[11]中方法,通過HE 染色評估支氣管炎性細胞浸潤并對其進行評分;同時,采用Image J 軟件計算PAS 陽性染色面積和氣道膠原染色面積,并對其進行評分。

      1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗 將收集到的肺泡灌洗液靜置后1 500 r/min 離心10 min,取上清,采用ELISA 法檢測各組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 的含量。實驗步驟嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

      1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 取適量肺組織,加入預冷的Trizol 溶液提取總RNA,凝膠電泳和分光光度計檢測RNA分子量和純度。取8 μL 總RNA,加入反轉錄反應液后42℃孵育60 min 合成cDNA。以cDNA 為模板進行擴增,按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒說明書將各試劑進行混勻后上機檢測。PCR 引物序列如 下,IL-4:上 游:5′-TACCAGGAGCCA TATCCACGGATG-3′,下游:5′-TGTGGTGTTCTTCGTTGCTGTGAG-3′,長 度183 bp;IL-5:上 游:5′-GGCCACTGCCATGGAGATTCC-3′,下 游:5′-AGCCTCAT CGTCTCATTGCTTGTC-3′,長 度340 bp;IL-13:上 游:5′-CGGCAGCATGGTAT GGAGTGTG-3′,下 游:5′-GGAGGCTGGAGACCGTAGTGG-3′,長 度123 bp;IL-33:上游:5′-CAATCAGGCGACGGTGTGGATG-3′,下 游 : 5′-GGAGTAGTCCTTGTC GTTGGCATG-3′,長 度 247 bp;GAPDH:上 游:5′-GGGTGTGAACCACGAGA AAT-3′,下 游:5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′,長度191 bp。擴增條件:95 ℃30 s,95 ℃5 s,60 ℃30 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內參基因,以目標基因與GAPDH擴增產(chǎn)物的2–ΔΔCt比值分析計算各個組的表達情況。

      1.3.5 流式細胞術 取適量肺組織研磨后以細胞過濾器過濾后置于EP 管中,加入銨-氯-鉀裂解緩沖液與冰上裂解細胞懸液中的紅細胞,離心棄上清,加入1 mL 的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后繼續(xù)離心棄上清。加入磷酸緩沖鹽溶液以制備單細胞懸液,并調整細胞濃度。分別以Linage、SCA-1 和CD90.2 標記為ILC2,CD11b、F4/80 及CD206 標記M2 型巨噬細胞,4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清,加入200 μL磷酸緩沖鹽溶液后以40 μL 的多聚甲醛固定,上機檢測,并應用CytExpert 軟件對數(shù)據(jù)進行處理及分析。

      1.3.6 蛋白免疫印跡實驗(Western blot) 取適量肺組織剪碎后冰上裂解,離心取上清,BCA 法測定蛋白濃度,上樣,電泳,轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST 洗膜3 次,每次5 min,加入稀釋的ST-2,F(xiàn)IZZ1、Arg-1 和β-actin 抗體,4℃孵育過夜,TBST洗膜后加入HRP 標記的二抗于37℃繼續(xù)孵育1 h,加入適量ECL 顯影,于凝膠成像系統(tǒng)中分析目的蛋白的相對表達量。

      1.4 統(tǒng)計學處理

      采用SPSS23.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)的形式表示。多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩的比較采用LSD 檢驗,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

      2 結果

      2.1 平喘顆粒對氣道炎癥及膠原沉積的影響

      造模后小鼠氣道周圍可見大量的炎癥細胞浸潤伴有管腔狹窄,同時可見大量的杯狀細胞化生和膠原沉積,與空白組相比,模型組炎癥評分、PAS 評分和膠原染色面積明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平喘顆粒組和IL-33 組氣道周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞化生和膠原沉積情況明顯改善,其中炎癥評分、PAS 評分和膠原染色面積與模型組比較明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

      表1 平喘顆粒對哮喘小鼠氣道炎癥及膠原沉積的影響(n=10,±s)Tab 1 Effect of Pingchuan granules on airway inflammation and collagen deposition in asthmatic mice(n=10,±s)

      表1 平喘顆粒對哮喘小鼠氣道炎癥及膠原沉積的影響(n=10,±s)Tab 1 Effect of Pingchuan granules on airway inflammation and collagen deposition in asthmatic mice(n=10,±s)

      注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

      組別空白組模型組平喘顆粒組IL-33 組膠原染色面積(%)2.30±0.18 11.87±1.53*4.45±0.31#4.18±0.29#279.005 0.000 FP炎癥評分(分)0.10±0.32 3.40±0.52*1.40±0.52#1.10±0.57#80.093 0.000 PAS 評分(分)0.20±0.42 3.00±0.67*1.50±0.71#1.00±0.67#35.468 0.000

      圖1 平喘顆粒對哮喘小鼠氣道炎癥及膠原沉積的影響Fig 1 Effect of Pingchuan granule on airway inflammation and collagen deposition in asthmatic mice

      2.2 平喘顆粒對肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 蛋白表達的影響

      與空白組相比,模型組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 的含量顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平喘顆粒和IL-33 均能明顯抑制肺泡灌洗液中炎性細胞因子的含量,與模型組比較,平喘顆粒組和IL-33 組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 的含量明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

      表2 平喘顆粒對肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 蛋白表達的影響(pg/mL,n=10,±s)Tab 2 Effect of Pingchuan granules on IL-4,IL-5,IL-13 and IL-33 protein expression in alveolar lavage fluid(pg/mL,n=10,±s)

      表2 平喘顆粒對肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 蛋白表達的影響(pg/mL,n=10,±s)Tab 2 Effect of Pingchuan granules on IL-4,IL-5,IL-13 and IL-33 protein expression in alveolar lavage fluid(pg/mL,n=10,±s)

      注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

      組別空白組模型組平喘顆粒組IL-33 組IL-33 5.76±0.48 17.83±2.27*7.84±1.31#7.30±1.29#138.400 0.000 FP IL-4 0.60±0.16 2.18±0.34*1.36±0.21#1.23±0.15#81.437 0.000 IL-5 0.06±0.02 3.30±0.95*1.37±0.21#1.33±0.16#73.659 0.000 IL-13 2.16±0.23 12.39±1.05*4.49±0.32#4.62±0.22#613.416 0.000

      2.3 平喘顆粒對肺組織中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 mRNA 表達的影響

      與肺泡灌洗液中炎癥細胞因子的趨勢相同,模型 組 肺 組 織 中IL-4、IL-5、IL-13和IL-33mRNA 的表達較空白組明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而平喘顆粒組和IL-33 組肺組織中IL-4、IL-5、IL-13和IL-33mRNA 的表達明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

      表3 平喘顆粒對肺組織中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 mRNA 表達的影響(n=10,±s)Tab 3 Effect of Pingchuan Granules on the expression of IL-4,IL-5,IL-13 and IL-33 mRNA in lung tissue(n=10,±s)

      表3 平喘顆粒對肺組織中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 mRNA 表達的影響(n=10,±s)Tab 3 Effect of Pingchuan Granules on the expression of IL-4,IL-5,IL-13 and IL-33 mRNA in lung tissue(n=10,±s)

      注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

      組別空白組模型組平喘顆粒組IL-33 組IL-33 1.00±0.01 3.81±0.65*1.64±0.20#1.67±0.27#112.836 0.000 FP IL-4 1.00±0.01 3.81±0.43*2.28±0.34#2.27±0.39#118.041 0.000 IL-5 1.00±0.01 3.80±0.52*3.09±0.22#3.04±0.17#166.570 0.000 IL-13 1.00±0.02 5.18±1.03*2.76±0.27#2.75±0.28#96.930 0.000

      2.4 平喘顆粒對肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞數(shù)量的影響

      與空白組比較,模型組小鼠肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞的數(shù)量顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平喘顆粒和IL-33 均能明顯降低肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞的數(shù)量,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表4。

      表4 平喘顆粒對肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞數(shù)量的影響(%,n=10,±s)Tab 4 Effect of Pingchuan granules on the number of ILC2 and M2 macrophages in lung tissue(%,n=10,±s)

      表4 平喘顆粒對肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞數(shù)量的影響(%,n=10,±s)Tab 4 Effect of Pingchuan granules on the number of ILC2 and M2 macrophages in lung tissue(%,n=10,±s)

      注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

      組別空白組模型組平喘顆粒組IL-33 組M2 型巨噬細胞的數(shù)量5.96±0.43 12.04±2.26*7.39±0.61#7.74±0.69#44.627 0.000 FP ILC2 的數(shù)量3.47±0.21 9.69±0.90*5.37±0.43#5.31±0.27#253.573 0.000

      圖2 平喘顆粒對肺組織中ILC2 和M2 型巨噬細胞數(shù)量的影響Fig 2 The effect of Pingchuan granule on the number of ILC2 and M2 macrophages in lung tissue

      2.5 平喘顆粒對ST-2、FIZZ1 和Arg-1 蛋白表達的影響

      與空白組相比,模型組肺組織中ST-2、FIZZ1和Arg-1 蛋白的表達顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平喘顆粒和IL-33 均能明顯降低肺組織中ST-2、FIZZ1 和Arg-1 蛋白的表達,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5、圖3。

      圖3 平喘顆粒對ST-2、FIZZ1 和Arg-1 蛋白表達的影響Fig 3 Effect of Pingchuan granules on the expression of ST-2,F(xiàn)IZZ1 and Arg-1 protein

      表5 平喘顆粒對ST-2、FIZZ1 和Arg-1 蛋白表達的影響(n=10,±s)Tab 5 Effect of Pingchuan granules on ST-2,F(xiàn)IZZ1 and Arg-1 protein expression(n=10,±s)

      表5 平喘顆粒對ST-2、FIZZ1 和Arg-1 蛋白表達的影響(n=10,±s)Tab 5 Effect of Pingchuan granules on ST-2,F(xiàn)IZZ1 and Arg-1 protein expression(n=10,±s)

      注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

      組別空白組模型組平喘顆粒組IL-33 組Arg-1/β-actin 0.33±0.03 0.79±0.12*0.49±0.12#0.58±0.13#32.599 0.000 FP ST-2/β-actin 0.22±0.07 0.90±0.17*0.46±0.17#0.33±0.19#253.573 0.000 FIZZ1/β-actin 0.14±0.04 0.77±0.11*0.27±0.12#0.30±0.14#36.369 0.000

      3 討論

      固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)是一類新發(fā)現(xiàn)的具有淋巴細胞特征而又不同于B 細胞和T 細胞的淋巴細胞群體,主要分布于淋巴器官、非淋巴器官、黏膜組織及血液中,作為Th2 的“鏡像細胞”在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮著重要的作用[12]。ILC 起源于共同淋巴樣祖細胞并在多種細胞因子的作用下,經(jīng)過自然殺傷細胞前體細胞和共同輔助性固有淋巴樣細胞前體細胞階段后,最終發(fā)育成ILCs。根據(jù)轉錄因子的不同,ILCs 可分為ILC1、ILC2 和ILC3 三個亞群,其中ILC2 以不表達或者低表達Lineage 識別分子和高表達SCA1、CD90.2 和c-Kit 等 表 面 分 子 為 主 要 特 征[13-15]。ILC2 亞 群 通 過表達轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor γt,RORγt)并 分 泌IL-4、IL-5和IL-13 等Th2 型炎性細胞因子從而影響哮喘的發(fā)生與發(fā)展。作為ILC2 的經(jīng)典活化因子,IL-33 通過與細胞表面的ST-2 受體結合,從而激活ILC2 并分泌大量Th2 型炎癥因子[16]。本研究結果顯示,平喘顆粒能夠減少哮喘小鼠模型肺泡灌洗液中和肺組織中IL-4、IL-5、IL-13 和IL-33 的表達,下調肺組織中ST-2 蛋白和ILC2 的數(shù)量,從而抑制ILC2 的活化。

      巨噬細胞是肺組織中最豐富的免疫細胞群,主要包括肺間質巨噬細胞和肺泡巨噬細胞,其中肺泡巨噬細胞與哮喘的關系最為密切[17]。免疫微環(huán)境對肺泡巨噬細胞的功能具有主要的作用,呼吸道過敏原通過激活肺上皮細胞或其他免疫細胞群從而釋放多種細胞因子影響肺泡巨噬細胞的遷移與極化。根據(jù)巨噬細胞激活的后的功能狀態(tài),可以將其分為經(jīng)典激活型(M1 型)和替代激活型(M2 型)兩種類型,其中M2 型巨噬細胞主要由IL-4 和IL-13 誘導。有研究證實,M2 型巨噬細胞過度活化會增加炎癥細胞募集、增加黏液分泌以及氣道高反應性,而抑制M2 巨噬細胞的活化能夠明顯減輕曲霉孢子所引起的氣道高反應性和氣道炎癥[18]。此外,還有研究表示,M2 型巨噬細胞還可以通過高表達FIZZ1及Arg-1 從而參與哮喘氣道重塑[19]。因此研究巨噬細胞的極化在哮喘中的作用,尤其是平喘顆粒對M2 型巨噬細胞的影響,對了全面闡釋平喘顆粒抑制哮喘氣道重塑的作用具有十分重要的意義。本研究結果顯示,平喘顆粒能夠顯著降低肺組織中M2 型巨噬細胞的數(shù)量,同時下調肺組織中FIZZ1和Arg-1 蛋白的表達。

      平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、太子參、黃芪、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼和知母組成,是導師李竹英教授治療哮喘緩解期的經(jīng)驗處方,具有益氣溫陽、化痰平喘的功效[20]。方中以炙麻黃和淫羊藿共同作為君藥,具有宣肺溫陽平喘的作用;以太子參、黃芪補氣生津,不僅可助君藥溫陽又不會引起津液耗傷,共為臣藥。五味子、款冬花、地龍斂肺止咳、化痰平喘,作為佐藥。罌粟殼助五味子斂肺止咳,知母潤肺止咳,專入肺腎二經(jīng),共為使藥。本研究結果顯示,平喘顆粒能夠降低哮喘小鼠模型氣道炎癥水平,并且抑制上皮杯狀細胞化生和膠原沉積,對氣道重塑具有較好的改善作用。

      綜上所述,平喘顆粒可以改善哮喘氣道重塑,其作用機制主要是通過抑制ILC2 介導的M2 型巨噬細胞極化實現(xiàn)的。

      作者貢獻度說明:

      王瑤:指標檢測及論文撰寫;袁星星:動物造模及藥物干預,數(shù)據(jù)分析;田春燕:動物造模及藥物干預;李竹英:課題設計及校審。

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