漢黃芩素調(diào)控膽綠素還原酶A 對結(jié)腸癌細胞的抑制作用

毛海燕 殷旭東 喬大偉 孔桂美 卜 平*

（1.揚州大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 揚州225000； 2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合系，江蘇 揚州225009）

結(jié)直腸癌是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點。據(jù)統(tǒng)計，結(jié)直腸癌在中國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率居于第三，死亡率居于第二［1］。對于晚期結(jié)直腸癌患者，許多患者不能耐受化療，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療顯現(xiàn)出優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)許多中藥復(fù)方及中藥單體都具有抗腫瘤活性，本課題組前期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌術(shù)后患者脾虛濕毒證較多，自擬健脾解毒方，采用高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)驗方健脾解毒方的主要活性單體為漢黃芩素。漢黃芩素是從中藥黃芩中提取出來的一種黃酮類成分，近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素在胰腺癌［2］、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中都表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性及抗血管生成［3?6］作用，在惡性腫瘤的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。膽綠素還原酶A（Biliverdin reductase A，BLVRA）是一種進化上高度保守的可溶性NADH 依賴酶，廣泛分布于動植物細胞漿內(nèi)［7］，是膽綠素代謝的限速酶，能夠促進膽綠素向膽紅素轉(zhuǎn)化，維持細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的動態(tài)平衡，其調(diào)節(jié)細胞的生長和增殖，在人類腫瘤中，其在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達增加，從而促進腫瘤生長。

1 材料

1.1 細胞株 人結(jié)腸癌細胞株LOVO、SW620、HCT116、SW480、HT29 和正常腸上皮細胞FHC 購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥物及試劑 漢黃芩素（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號632?85?9，純度＞99.8%）；5?FU（武漢百浩天生物科技有限公司，批號H31020593）；DMEM、RPMI?1640及F?12K細胞培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號分別為AE2944968、AE29456629、AE2944653）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號42F6590 K）；胰蛋白酶?乙二胺四乙酸（EDTA）混合液（美國Gibco 公司，批號1665746）；MTT試劑盒（武漢百浩天生物科技有限公司，批號H152440）；Annexin V?異硫氰酸熒光素（FITC，美國BD 公司，批號B148219）；碘化丙碇（PI，美國BD 公司，批號25535）；NaOH（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號10019764）；Trizol 總RNA 提取試劑（美國Invitrogen 公司，批號9108）；蛋白裂解試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號P6730）；BCA 蛋白定量試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號RK242682）；逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈式反應(yīng)（RT?PCR）及實時熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號RR820 A、RR036 A）；所用的PCR 引物BLVRA和GAPDH由上海金斯頓生物技術(shù)公司合成；BLVRA、E?cadherin、Vimentin、snail、Bcl?2、BAX、GAPDH 一抗和羊抗兔辣根過氧化酶（HRP）二抗（美國CST 公司，批號依次為393385、3195、5741、3879、4223、2772、MS01）；人工基底膜（Matrigel）（美國BD 公司，批號356234）；穿透小室（Transwell，美國Corning 公司，批號3422）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 實驗用所有細胞株均培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U／mL 青鏈霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞處于對數(shù)生長期時進行下一步實驗。

2.2 MTT 檢測細胞增殖能力 根據(jù)細胞篩選結(jié)果，取對數(shù)生長期HT29 和SW620細胞作為目的細胞，細胞濃度為1×105／mL 的細胞懸液，每孔100 μL 接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后加入不同質(zhì)量濃度（0、20、40、80、160 μg／mL）［8］漢黃芩素溶液（0.4% NaOH 溶解）及12.5 μg／mL 的5?FU，每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL），培養(yǎng)4 h 后加入150 μL DMSO，搖床搖動10 min，酶標儀測定490 nm 的吸光度值（OD）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 6 孔板培養(yǎng)HT29 及SW620細胞，經(jīng)不同質(zhì)量濃度漢黃芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5?FU 處理，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，收集上液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后棄去上清，胰酶消化收集2×105個細胞，100 μL 結(jié)合緩沖液重懸，加入400 μL PBS，按照試劑盒說明書方法，室溫下每管加入PI 染液5 μL，Annexin V?FITC 10 μL，避光孵育15 min 后流式細胞儀檢測，根據(jù)公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率＝（凋亡的細胞數(shù)／總細胞數(shù)）×100%。

2.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 按1∶8 比例稀釋Matrigel 膠，加入60 μL Matrigel 膠稀釋液包被、水化Transwell 小室底部膜，放37 ℃培養(yǎng)箱過夜，遷移能力檢測不加Matrigel 膠。無血清培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至4×105／mL，加200 μL 到上室，下室加入含20% 胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL。分別不同終質(zhì)量濃度漢黃芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5?FU 處理細胞，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，細胞培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，PBS 漂洗3 次，棉簽小心擦去上室表面細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在高倍鏡下計數(shù)小室膜下面侵襲的細胞數(shù)，計數(shù)中間和四周5個視野，取平均值。

2.5 RT?PCR 檢測BLVRAmRNA 的表達 不同質(zhì)量濃度漢黃芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5?FU 處理HT?29 和SW620細胞24 h，收集細胞，Trizol 提取總RNA 并進行cDNA 合成，RT?PCR 檢測BLVRAmRNA 表達。引物序列，BLVRA正向 5′?GGAATCCACACCCTT CCTCA?3′，反向5′?CTTGGCTGGAAAGAGCATCC?3′；GAPDH正向5′ ?CACCCACTCCTCCACCTTTG?3′，反向5′?CCACCACCCTGTTG CTGTAG?3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃持續(xù)10 s，60 ℃、34 s，72 ℃、10 s，40個循環(huán)，計算2－ΔΔCT用于分析基因的相對表達。

2.6 Western blot 檢測BLVRA 蛋白及EMT 和細胞凋亡相關(guān)蛋白表達 將2×105個HT29 和SW620細胞種植于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后加入不同質(zhì)量濃度漢黃芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5?FU 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS 漂洗3 次，加入蛋白裂解混合液（Lysis Buffer 1 mL，10 μL 磷酸酶抑制劑，1 μL 蛋白酶抑制劑和5 μL 100 mmol／L PMSF 提取全蛋白，整個過程在冰上操作。BCA法測定蛋白濃度，步驟按說明書進行。蛋白樣品20 μg 進行多聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳液，5% BSA 室溫搖床封閉2 h后加入一抗4 ℃孵育過夜，用洗膜緩沖液（TBST）搖床洗滌3 次，10 min／次，二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST 緩沖液搖床洗滌3 次，10 min／次，超敏化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光，采集圖像后ImageJ分析數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3 次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料采用（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞篩選結(jié)果 RT?PCR 及Western blot 檢測結(jié)果顯示，五株結(jié)腸癌細胞中BLVRA 表達均高于FHC細胞（P＜0.05，P＜0.01），篩選出BLVRA 低表達的SW620細胞和高表達的HT29細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 不同細胞株BLVRA 表達（， n＝3）

3.2 漢黃芩素抑制結(jié)腸癌HT29 和SW620細胞的增殖能力 與空白組比較，隨著漢黃芩素濃度的增高，漢黃芩素處理HT29 及SW620細胞24、48、72 h，細胞增殖能力降低（P＜0.05，P＜0.01），其抑制效應(yīng)隨著作用濃度及作用時間的延長逐漸增加；與5?FU組比較，漢黃芩素（160 μg／mL）組在72 h 時對HT?29細胞抑制作用明顯（P＜0.01），而漢黃芩素（160 μg／mL）組在48 h 及72 h 時對SW620細胞抑制作用明顯（P＜0.01）。見表1～2。

表1 漢黃芩素抑制HT29細胞的增殖作用（， n＝5）

表1 漢黃芩素抑制HT29細胞的增殖作用（， n＝5）

注：與空白組（0 μg／mL）比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與5?FU組比較，＃＃P＜0.01。

表2 漢黃芩素抑制SW620細胞的增殖作用（， n＝5）

表2 漢黃芩素抑制SW620細胞的增殖作用（， n＝5）

注：與空白組（0 μg／mL）比較，**P＜0.01；與5?FU組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 不同濃度漢黃芩素能促進結(jié)腸癌HT29 和SW620細胞凋亡 與空白組比較，漢黃芩素對HT29 及SW620細胞的促凋亡作用隨著藥物濃度的增加而增強（P＜0.01），與5?FU組相比，漢黃芩素（80、160 μg／mL）組對HT29細胞的促凋亡作用優(yōu)于5?FU組（P＜0.05，P＜0.01），漢黃芩素160 μg／mL組對SW620細胞的促凋亡作用更好（P＜0.01），而漢黃芩素低濃度組促凋亡作用劣于5?FU組，見圖2～3。

圖2 漢黃芩素對HT?29細胞凋亡的影響（， n＝3）

圖3 漢黃芩素對SW620細胞凋亡的影響（， n＝3）

3.4 不同濃度漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29、SW620 凋亡相關(guān)蛋白Bcl?2、BAX 的影響 與空白組比較，HT29細胞中漢黃芩素（40、80、160 μg／mL）組Bcl?2 表達逐漸下降，而BAX 的表達逐步升高（P＜0.01）；與5?FU組比較，漢黃芩素（160 μg／mL）作用明顯（P＜0.01）。SW620細胞中隨著漢黃芩素濃度的增加，Bcl?2 表達逐漸下降（P＜0.01），而BAX 的表達逐步升高（P＜0.05，P＜0.01），與5?FU組比較，漢黃芩素（160 μg／mL）組Bcl?2 的表達降低（P＜0.05），漢黃芩素（80、160 μg／mL）組BAX 的表達差異明顯（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4～5。

圖4 漢黃芩素對HT?29細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（， n＝3）

圖5 漢黃芩素對SW620細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（， n＝3）

3.5 不同濃度漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29 和SW620細胞遷移和侵襲能力的影響 與空白組比較，隨著漢黃芩素濃度的升高，HT29細胞遷移和侵襲能力逐漸下降（P＜0.01）；與5?FU組比較，漢黃芩素（80、160 μg／mL）組抑制作用更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，隨著漢黃芩素濃度的升高，SW620細胞遷移和侵襲能力逐漸下降（P＜0.05，P＜0.01）；與5?FU組比較，漢黃芩素（160 μg／mL）組抑制作用更明顯（P＜0.01）。見圖6～9。

圖6 漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29細胞遷移能力的影響（×100）（n＝3）

圖7 漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29 侵襲能力的影響（×100）（n＝3）

圖8 漢黃芩素對結(jié)腸癌SW620細胞遷移能力的影響（×100）（n＝3）

圖9 漢黃芩素對結(jié)腸癌SW620細胞侵襲能力的影響（×100）（n＝3）

3.6 不同濃度漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29 和SW620細胞EMT相關(guān)蛋白的影響 與空白組比較，漢黃芩素（40、80、160 μg／mL）促進HT29細胞E?cadherin 表達，對snail 的抑制作用逐漸增強（P＜0.01），漢黃芩素（20、40、80、160 μg／mL）對Vimentin 的抑制作用逐漸增強（P＜0.05，P＜0.01）；與5?FU組比較，漢黃芩素（160 μg／mL）對Vimentin 及snail 抑制作用更明顯（P＜0.05），其對E?cadherin 促進作用與5?FU組相似。與空白組比較，漢黃芩素（40、80、160 μg／mL）促進SW620細胞E?cadherin 表達（P＜0.05，P＜0.01），漢黃芩素（20、40、80、160 μg／mL）對Vimentin 及snail 的抑制作用逐漸增強（P＜0.05，P＜0.01）；與5?FU組比較，漢黃芩素（80、160 μg／mL）對E?cadherin 的促進作用及snail抑制作用明顯（P＜0.05），漢黃芩素（160 μg／mL）對Vimentin 的抑制作用更優(yōu)（P＜0.05）。見圖10～11。

圖10 漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29細胞EMT 相關(guān)蛋白的影響（， n＝3）

圖11 漢黃芩素對結(jié)腸癌SW620細胞EMT 蛋白的影響（， n＝3）

3.7 不同濃度漢黃芩素對BLVRA 蛋白的影響 與空白組比較，漢黃芩素（40、80、160 μg／mL）可抑制HT29細胞BLVRA 蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01），而在SW620細胞中，隨著漢黃芩素濃度的升高，對BLVRA 的抑制作用越來越強（P＜0.01）；與5?FU組比較，HT29細胞中漢黃芩素（80、160 μg／mL）對BLVRA 的抑制作用優(yōu)于5?FU組（P＜0.01），而在SW620細胞中漢黃芩素顯現(xiàn)出與5?FU 類似的抑制作用（P＞0.05）。見圖12～13。

圖12 漢黃芩素對結(jié)腸癌HT29細胞BLVRA 蛋白的影響（， n＝3）

圖13 漢黃芩素對結(jié)腸癌SW620細胞BLVRA 蛋白的影響（， n＝3）

4 討論

結(jié)直腸癌是我國乃至全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，隨著飲食習慣及生活環(huán)境的變化，在我國結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢［9］。雖然越來越多的新型抗腫瘤藥及免疫治療藥物問世，但結(jié)直腸癌的治療效果仍不理想。近年來，多種中藥活性提取物在多種惡性腫瘤的進展中顯現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，成為腫瘤治療的研究熱點。本課題組成員前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)半枝蓮提取物及其含藥血清可抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成［10］。腫瘤細胞增殖、細胞凋亡以及腫瘤細胞遷移和侵襲是結(jié)直腸癌進展的關(guān)鍵步驟。漢黃芩素是從傳統(tǒng)中藥黃芩中提取的一種黃酮類化合物，研究表明其可以通過調(diào)節(jié)肝臟干細胞的增殖和凋亡來減輕肝纖維化［11］，多項研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素具有廣譜的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、減少腫瘤新生血管形成，同時還可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［12?14］。本研究結(jié)果顯示漢黃芩素能夠抑制結(jié)腸癌細胞系HT?29 及SW620細胞的增殖，且呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，同時漢黃芩素能夠促進腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，且呈現(xiàn)出劑量濃度依賴性，這一研究結(jié)果與李瑤瑤等［15］及樊帥君等［16］研究結(jié)果類似。由此可見，漢黃芩素對在結(jié)直腸癌細胞的發(fā)生發(fā)展中起著重要的抑制作用。Bcl?2 和BAX 是細胞凋亡通路的必需因子，BAX 存在于細胞質(zhì)中，能轉(zhuǎn)入到線粒體外膜，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，而Bcl?2 能抑制BAX 的轉(zhuǎn)入從而抑制細胞凋亡［17］，因此BAX 扮演著促凋亡角色，而Bcl?2 則起著相反的作用，兩者的比例決定著細胞凋亡的方向。本研究顯示隨著漢黃芩素濃度的提升，BAX 的表達水平呈上升趨勢，而Bcl?2 的表達水平則呈下降趨勢，明顯促進腫瘤細胞的凋亡。上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用，所有的EMT 亞組都顯現(xiàn)出相似的促進腫瘤細胞增殖的能力［18］。E?cadherin 在細胞與細胞之間的粘附過程中起著重要作用，其表達水平的下降是EMT 進程和細胞遷移的基本因素。Vimentin 被認為是細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個典型標志，snail 是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中誘導(dǎo)EMT 過程的關(guān)鍵作用因子之一，在腫瘤EMT 進程中Vimentin 及snail 的表達是上調(diào)的［19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠促進E?cadherin 的表達，抑制Vimentin 及snail的表達水平，且隨著劑量濃度的提高其作用更明顯，提示漢黃芩素可抑制結(jié)腸癌細胞的EMT 進程，從而抑制結(jié)腸癌進展。

膽綠素還原酶A（Biliverdin reductase A，BLVRA）是膽綠素還原酶（Biliverdin reductase，BVR）的一個主要亞型，是一種有效的抗氧化劑，能夠促進膽綠素向膽紅素轉(zhuǎn)化［20］，能作為細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長和增殖。其在多種腫瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤中呈現(xiàn)過表達水平［21?23］，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。BLVRA 的過表達能夠影響上千種基因、信號通路、細胞凋亡及免疫分子水平的表達，但是BLVRA 在結(jié)直腸癌中的作用尚未被研究，且漢黃芩素對其作用亦未得到研究。本研究結(jié)果顯示漢黃芩素作用結(jié)腸癌細胞24 h 后能夠抑制BLVRA 的表達，且顯現(xiàn)出劑量濃度依耐性。隨著BLVRA表達水平的下降，細胞增殖及細胞侵襲和遷移能力下降，細胞凋亡作用提高，而腫瘤的EMT 進程也明顯被抑制，表明漢黃芩素通過調(diào)控BLVRA 的表達水平可能是其發(fā)揮抑制結(jié)腸癌進展的作用機制之一。

綜上所述，漢黃芩素能夠通過調(diào)控BLVRA 的表達來有效抑制結(jié)腸癌細胞的進展，在結(jié)腸癌的防治中有一定療效，但其是否可通過其他信號通路及靶點來發(fā)揮抑制作用，且在體內(nèi)是否有相似的抗腫瘤作用仍需進一步深入研究。