田薊苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及其體內(nèi)藥動學(xué)研究

劉勇華張留超郭曉娜

（黃河科技學(xué)院，河南 鄭州450005）

田薊苷是香青蘭有效成分之一［1］，具有抗動脈硬化、抗高血壓、抗腫瘤、保護心腦血管系統(tǒng)等藥理活性［2?3］，但該成分屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BSC）中的4 類藥物［4］，水溶性、脂溶性均較差，口服給藥絕對生物利用度僅為1.35%［5］，大大限制了臨床應(yīng)用，故有必要借助新型制劑技術(shù)來開發(fā)出高口服吸收生物利用度的相關(guān)制劑。袁勇等［5］研究了田薊苷口服吸收屏障，發(fā)現(xiàn)其溶解度、溶出度、脂溶性均較差，而且易被酶解，是導(dǎo)致其口服吸收生物利用度低下的主要原因；決利利等［6］將田薊苷制成PLGA 嵌段共聚物納米粒來促進其腸道吸收，可提高口服生物利用度，但其包封率低，仍有較大提升空間。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體采用固?液脂質(zhì)載體包裹藥物，并通過制劑技術(shù)使粒徑處在納米級別，具有包封率和載藥量高、穩(wěn)定性好、有效促進藥物吸收等優(yōu)勢［7?11］。本實驗制備田薊苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，采用Box?Behnken 試驗優(yōu)化其制備工藝，研究其體內(nèi)藥動學(xué)，以期為相關(guān)制劑學(xué)研究提供借鑒。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（配置溫控進樣盤、DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；FA1004B型電子天平（0.01 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CL?200型系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SB3200?T型超聲波清洗儀［必能信超聲（上海）有限公司］；XW?80A型渦旋混合器（蕪湖天樂精密科學(xué)儀器有限公司）；DCY?Ⅱ型24 孔實驗室水浴氮氣吹掃儀（紹興蘇珀儀器制造有限公司）；Master?sizer型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；TMX?22R型高速離心機（美國貝克曼庫爾特公司）。

田薊苷對照品（批號19110423，純度98.0%，日本Tauto 公司）；田薊苷原料藥（批號P191105，純度97.2%，武漢宏信康精細化工有限公司）；油酸（批號F1902020，上海倍科化工有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號161025，北京鳳禮商貿(mào)有限公司）；超濾離心管（30 kDa，美國Millipore 公司）；泊洛沙姆188（批號201705?1，廣州川一化工有限公司）。

SD 大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012?0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測定田薊苷含量

2.1.1 色譜條件 Agilent SB?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相水（含0.2% 磷酸）?乙腈（35∶65）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長328 nm。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取田薊苷對照品10.80 mg，置于25 mL 量瓶中，加入20 mL 乙腈超聲提取30 s后室溫下定容至刻度（432 μg／mL），“2.1.1”項下流動相稀釋至54.0、21.6、5.4、1.08、0.108、0.054 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣20 μL 測定。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝22.157 4X＋1.953 4（r＝0.999 7），在0.054～54.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取1 mL 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液至10 mL 量瓶中，加入8 mL 乙腈超聲提取30 s，用“2.1.1”項下流動相定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷峰面積RSD 為1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷峰面積RSD 為1.05%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得田薊苷峰面積RSD 為0.63%，表明儀器精密度良好。取“2.1.2”項下432 μg／mL溶液5 mL 至10 mL 量瓶中，乙腈定容至刻度，得216 μg／mL對照品溶液，取9 份納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，每份1.0 mL，分為3組，分別加入上述對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，加入8 mL 乙腈超聲提取30 s，“2.1.1”項下流動相定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷平均加樣回收率分別為100.82%、99.51%、100.23%，RSD分別為0.53%、1.24%、0.93%。

2.2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備 采用乳化蒸發(fā)?低溫固化法。取處方量田薊苷及固態(tài)、液態(tài)脂質(zhì)油酸（固液脂質(zhì)比4∶1），置于圓底燒瓶中，加入80 mL無水乙醇，800 r／min 磁力攪拌一段時間，70 ℃水浴加熱溶解，作為有機相；取處方量泊洛沙姆188至250 mL 蒸餾水中，攪拌溶解，置于70 ℃水浴中，作為水相，將有機相滴加到水相中，繼續(xù)攪拌3 h 后超聲提取10 min，低溫固化10 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，補加蒸餾水至250 mL，即得。

2.3 包封率、載藥量測定 取1 mL 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液至10 mL 量瓶中，加入8 mL 乙腈超聲提取30 s 后“2.1.1”項下流動相定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，取2.5 mL 續(xù)濾液至10 mL 量瓶中，用“2.1.1”項下流動相定容至刻度，在“2.1.1”項色譜條件下測定田薊苷總含量。取1 mL納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，置于超濾管中，12 000 r／min 離心30 min，取外管續(xù)濾液，測定游離田薊苷含量，按文獻［12］報道的方法測定包封率、載藥量。

2.4 Box?Behnken 響應(yīng)面法 本實驗首先考察了固液脂質(zhì)比對包封率的影響，發(fā)現(xiàn)液態(tài)脂質(zhì)比例較小時不能有效形成晶體缺陷空間，不利于包裹藥物，從而影響包封率；但液態(tài)脂質(zhì)比例過大時，可能會導(dǎo)致相分離，結(jié)合課題組前期研究及文獻［11］，最終選擇固液脂質(zhì)比為4∶1。單因素試驗考察了不同田薊苷用量（30、40、50、60、70、80、90 mg）對包封率的影響，發(fā)現(xiàn)田薊苷用量越低，包封率越高，但過低會影響制備效率，最終選擇50～70 mg 進行優(yōu)化。不同質(zhì)量濃度（1.5、2.5、3.5、5.5、7.5、8.5、10 mg／mL）脂質(zhì)也會影響納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的包封率，較低時包封率往往較低，而大于7.5 mg／mL 時不再增加，最終選擇3.5～7.5 mg／mL 進行優(yōu)化。不同體積分數(shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）表面活性劑也會影響包封率，過低時影響乳化效果及包封率，過高時由于增溶作用使藥物進入水相，最終也會降低包封率，最終選擇1.0%～2.0% 進行優(yōu)化。

在此基礎(chǔ)上，固定固液脂質(zhì)比為4∶1，選擇田薊苷用量（X1）、脂質(zhì)質(zhì)量濃度（X2）、表面活性劑體積分數(shù)（X3）作為影響因素，包封率（Y）作為評價指標，Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

對表2 結(jié)果進行擬合，得到二次多元回歸方程為Y＝78.86－6.16X1＋3.85X2＋1.09X3－0.9X1X2＋（R2＝0.989 4，P＜0.000 1，F(xiàn)＝1.580＞0.05），可知該模型擬合線性較高，失擬度無顯著差異，可用于工藝優(yōu)化，方差分析見表3，可知X1、X2、X3、X1X3、X2X3、有顯著影響（P＜0.05）。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

通過Design Expert V8.0.6 軟件進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖1。由此可知，當表面活性劑體積分數(shù)為1.5%時，包封率隨著脂質(zhì)質(zhì)量濃度增加而升高，而隨著田薊苷用量增加其先升后降；當脂質(zhì)質(zhì)量濃度為5.5 mg／mL 時，隨著表面活性劑體積分數(shù)增加包封率先升后降，而隨著田薊苷用量增加總體呈現(xiàn)降低趨勢；當田薊苷用量為60 mg 時，隨著表面活性劑體積分數(shù)增加包封率先升后降，而隨著脂質(zhì)質(zhì)量濃度增加其先升后降。

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

設(shè)置包封率最大值為100%，最小值為0，得到最優(yōu)工藝為田薊苷用量53.9 mg，脂質(zhì)質(zhì)量濃度7.1 mg／mL，表面活性劑體積分數(shù)1.5%，再進行3批驗證試驗，測得平均包封率為82.5%，與預(yù)測值82.3%接近，表明模型穩(wěn)定可靠。同時，測得載藥量為2.32%。

2.5 凍干粉制備 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，加入5% 甘露醇混勻，分裝于西林瓶中，置于－60 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍2 d 后在－25 ℃冷凍干燥儀中抽真空2 d，即得，取出，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 粒徑、Zeta 電位測定 取凍干前混懸液及蒸餾水復(fù)溶后的凍干粉，測定其粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見表4、圖2～3。由此可知，復(fù)溶后包封率、Zeta 電位絕對值降低，平均粒徑、PDI 升高。

表4 凍干前后各指標比較Tab.4 Comparison of various indices before and after lyophilization

圖2 田薊苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of tilianin nanostructured lipid carriers

圖3 田薊苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of tilianin nanostructured lipid carriers

2.7 體外釋藥研究 設(shè)定攪拌槳轉(zhuǎn)速為75 r／min，溫度為（37±1）℃，釋放介質(zhì)為900 mL 0.5%SDS溶液。取凍干粉（田薊苷量為10 mg）適量至空白0.5%SDS 溶液中，振蕩后置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），細尼龍繩兩端扎緊，另取原料藥同法操作，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、36、48 h 各取樣2 mL，同時注入2 mL空白0.5%SDS 溶液，8 000 r／min 離心15 min，取上清液，HPLC 法測定田薊苷含量，結(jié)果見圖4。由此可知，原料藥12 h 內(nèi)累積釋放度達到最大值38.3%，12～48 h 基本不再增加；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體前6 h 釋藥較快，6～48 h 累積釋放度逐漸增加，最高在80%左右；體外釋藥與Weibull 模型的擬合度最高，方程為lnln（1／1－Mt／M∞）＝0.479 5lnt－0.862 7（R2＝0.982 9），其中Mt／M∞為t時間釋放率，Mt、M∞分別為t、∞時間累積釋放度。

圖4 田薊苷體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curves for tilianin

2.8 體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.8.1 分組、給藥與取血 12 只大鼠隨機分為2組，5%CMC?Na 溶液制備灌胃液（田薊苷質(zhì)量濃度為2.5 mg／mL），給藥劑量為15 mg／kg，于0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血至肝素化離心管中，3 000 r／min 離心2 min，低溫保存上層血漿。

2.8.2 血漿樣品處理 參考文獻［6］報道。精密吸取解凍血漿樣品200 μL，置于離心管中，加入2 mL 乙腈，密封后渦旋5 min，8 000 r／min 離心15 min，取上層有機相，50 ℃氮吹儀緩慢吹干，200 μL 乙腈復(fù)溶，8 000 r／min 離心6 min，進樣分析。

2.8.3 線性關(guān)系考察 取田薊苷對照品適量，乙腈制成2 000、1 000、500、250、100、20 μg／L 溶液，分別取200 μL，50 ℃氮吹儀緩慢吹干后加入200 μL 空白血漿，密封后渦旋5 min，按“2.8.2”項下方法處理，得到血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝0.041 2X－2.158 4（r＝0.993 5），在20～2 000 μg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 方法學(xué)考察 取20、500、2 000 μg／L 血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得田薊苷峰面積RSD分別為9.62%、3.89%、4.11%，表明儀器精密度良好。取血漿樣品，于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷峰面積RSD 為10.18%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取上述3種質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷平均加樣回收率分別為90.31%、87.62%、94.67%。取20 μg／L血漿對照品溶液，逐步稀釋后在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷定量限為5 μg／L，檢測限為2 μg／L。

2.8.5 結(jié)果分析圖5、表5 顯示，與原料藥比較，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體tmax延長（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），口服相對生物利用度增加至4.07 倍。

圖5 田薊苷血藥濃度?時間曲線Fig.5 Plasma concentration?time curves for tilianin

表5 田薊苷主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for tilianin（， n＝6）

表5 田薊苷主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for tilianin（， n＝6）

注：與田薊苷比較，**P＜0.01。

3 討論

課題組前期分別考察了不同用量甘露醇、蔗糖、海藻糖作為凍干劑，發(fā)現(xiàn)5%甘露醇凍干效果最佳，可能是由于其分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，與粒子表面形成氫鍵，在升華、脫水過程中替代了水的作用［12?13］，從而在最大程度上保護了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的整體結(jié)構(gòu)，所制得凍干粉末外觀致密，不塌陷，復(fù)溶效果好。

本實驗曾考慮采用熔融乳化?超聲法制備田薊苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，但該方法所需表面活性劑用量較大［12，14?15］，而引入乙醇 （即采用乳化蒸發(fā)?低溫固化法）后其用量下降至1.5%。文獻［4］報道，田薊苷在37 ℃水中的溶解度為1.57 mg／L，而在0.5%SDS 溶液中達到67.09 mg／L，符合漏槽條件，但原料藥在12 h 內(nèi)的累積釋放度僅為38.3%，可能與其顆粒較大、疏水性較強有關(guān)。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體一般有包裹、吸附2種方式載藥［16?17］，在除去體系中有機溶劑時，部分藥物被吸附在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的表層或淺表層，釋藥較為容易，可能是納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的田薊苷在前6 h 釋藥較快的主要原因；在包裹載藥方式下藥物釋放相對緩慢，可能是6～48 h 該成分累積釋放度逐漸增加的主要原因。

藥動學(xué)結(jié)果顯示，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體顯著延緩了田薊苷tmax，可能與其本身粒徑較小、具有很強的胃腸道粘附性有關(guān)；該成分Cmax、相對口服吸收生物利用度升高，可能是由于該劑型本身具有促進藥物胃腸道吸收的作用［16］，同時其包裹作用可避免藥物被酶解、破壞，提高了后者與胃腸道的接觸面積，增加了后者經(jīng)胞間、淋巴轉(zhuǎn)運等進入血液循環(huán)的幾率，從而促進吸收。