DHRS2抑制肝細(xì)胞肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的功能研究①

馬 軼 滕 穎 劉 慧 畢 爽（沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院介入科，沈陽(yáng)110006）

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球排名第六，死亡率排名第四，每年約有84萬(wàn)例新發(fā)病例和78萬(wàn)例死亡病例，其死亡率僅低于發(fā)病率［1］。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類(lèi)型，占肝癌的90%以上。盡管HCC的治療有所改善，但由于其疾病診斷時(shí)常處于晚期，導(dǎo)致治療具有較大局限性，HCC患者的預(yù)后和生存率仍然令人沮喪［2］。因此更徹底地了解HCC的發(fā)病分子機(jī)制，并找到更有效的治療策略至關(guān)重要。脫氫酶∕還原酶SDR家族成員2（dehydrogenase∕reductase SDR family member 2，DHRS2）也稱HEP27，最初由GABRIELLI等［3］專家從HepG2細(xì)胞系中克隆而來(lái)，并發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙?；敢种苿┒∷徕c處理HepG2細(xì)胞后，DHRS2在細(xì)胞核中積累，并誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G1期。同時(shí)有研究表明，DHRS2在結(jié)直腸癌、鼻咽癌和卵巢癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，其表達(dá)水平與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［4-6］。但DHRS2在HCC中發(fā)揮的具體作用目前還未見(jiàn)報(bào)道，因此本文對(duì)此進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)DHRS2抑制HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，可能是HCC新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料HCC細(xì)胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細(xì)胞系LO2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院；DMEM高糖培養(yǎng)基和FBS購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因公司；CCK8試劑購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司；6孔板、96孔板和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白裂解液和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶試劑公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和人髓性分化原發(fā)反應(yīng)蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 于http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html網(wǎng)站頁(yè)面中選擇“HCC”，并輸入“DHRS2”基因進(jìn)行分析，得出TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC組織和正常肝組織中DHRS2的表達(dá)水平。于http：∕∕kmplot.com∕analysis∕index.php？p=service網(wǎng)站頁(yè)面中腫瘤類(lèi)型選擇“HCC”，并輸入“DHRS2”基因，點(diǎn)擊總生存期分析，得出kaplan meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中DHRS2的表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的影響。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細(xì)胞系LO2復(fù)蘇后重懸至含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Huh-7細(xì)胞以2×105個(gè)∕孔接種于6孔板，分為對(duì)照組（NC組）和DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（oe-DHRS2組），鋪板12 h，采用脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至各組Huh-7細(xì)胞，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh-7細(xì)胞以1 500個(gè)∕孔鋪至96孔板，分為NC組和oe-DHRS2組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，按上述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染。分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的第24 h、48 h、72 h和96 h，加入CCK8試劑，繼續(xù)孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh-7細(xì)胞，以500個(gè)∕孔鋪至6孔板，分為NC組和oe-DHRS2組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按上述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右時(shí)，形成肉眼可見(jiàn)的克隆團(tuán)。PBS洗去培養(yǎng)基后，加入甲醇固定，吉姆薩染色，干燥掃描后計(jì)數(shù)克隆團(tuán)。

1.2.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 取上述轉(zhuǎn)染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細(xì)胞，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，PBS洗3次后，按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒染色，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期比例。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 取上述轉(zhuǎn)染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次后，取1×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，PBS洗去Transwell小室上室面細(xì)胞，甲醇固定下室面細(xì)胞，吉姆薩染色，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 Western blot取上述轉(zhuǎn)染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細(xì)胞，PBS洗3次后，加入蛋白裂解液，超聲儀裂解破碎細(xì)胞，14 000 r∕min、4℃離心30 min。獲取上清液，并檢測(cè)蛋白濃度。采用10% SDSPAGE 80 V電泳分離蛋白，350 mA濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA室溫孵育PVDF膜1 h，TLR4和MyD88一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光條帶。Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)兩組間差異，單因素方差統(tǒng)計(jì)多組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHRS2在HCC組織中的表達(dá)水平TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHRS2在HCC組織中的表達(dá)水平，分析結(jié)果顯示DHRS2 mRNA在371例HCC組織中的表達(dá)低于在50例正常肝組織中的表達(dá)水平（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHRS2在HCC組織中表達(dá)減少Fig.1 TCGA database analysis of reduced expression of DHRS2 in HCC tissues

2.2 DHRS2對(duì)HCC患者預(yù)后的影響Kaplan meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHRS2的表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示1 307例低表達(dá)DHRS2的HCC患者較3 792例高表達(dá)DHRS2的HCC患者的預(yù)后差，見(jiàn)圖2。

圖2 Kaplan-meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析低表達(dá)DHRS2的HCC患者預(yù)后差Fig.2 Kaplan-meier plotter database analyzed poor prog?nosis of HCC patients with low expression of DHRS2

2.3 DHRS2在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平Western blot檢測(cè)DHRS2在HCC細(xì)胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細(xì)胞系LO2中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，DHRS2在HCC細(xì)胞中的表達(dá)均低于在正常肝細(xì)胞系LO2中的表達(dá)，在Huh-7細(xì)胞中的表達(dá)最低（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。選擇Huh-7進(jìn)行DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示，DHRS2在oe-DHRS2組細(xì)胞中的表達(dá)高于在NC組細(xì)胞中的表達(dá)，DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)?？娠@著增加Huh-7細(xì)胞中DHRS2的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖3 DHRS2在各細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.3 Expressions of DHRS2 in each cell lines

2.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞Huh-7后，與NC組相比，oe-DHRS2組細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHRS2抑制HCC細(xì)胞增殖能力Fig.4 CCK8 assay detected ability of DHRS2 to inhibit proliferation of HCC cells

2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞Huh-7后，NC組細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目為（54.65±10.15）%，oe-DHRS2組細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目為（18.42±3.51）%。與NC組相比，oe-DHRS2組細(xì)胞克隆形成能力降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞Huh-7后，NC組G2∕M期細(xì)胞比率為（13.52±3.58）%，oe-DHRS2組G2∕M期細(xì)胞比率為（28.68±7.58）%。與NC組相比，oe-DHRS2組G2∕M期細(xì)胞比率增加（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHRS2誘導(dǎo)HCC細(xì)胞阻滯在G2/M期Fig.6 Cell cycle assay detected DHRS2 induction of HCC cell arrest in G2/M phase

2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞Huh-7后，NC組細(xì)胞穿膜數(shù)目為（70.67±3.79）%，oe-DHRS2組細(xì)胞穿膜數(shù)目為（32.67±3.78）%。與NC組相比，oe-DHRS2組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHRS2抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力Fig.7 Transwell assay detected ability of DHRS2 to inhibit HCC cell metastasis

2.8 Western blot檢 測(cè)TLR4∕MyD88信 號(hào) 通 路 活性DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞Huh-7后，與NC組相比，oe-DHRS2組細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 Western blot檢測(cè)DHRS2抑 制TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)Fig.8 Western blot detected DHRS2 inhibit expressions of TLR4 and MyD88 proteins

3 討論

HCC是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其在亞洲發(fā)病尤為普遍，約有一半的HCC新發(fā)患者來(lái)自中國(guó)［1］。HCC的主要危險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，以及黃曲霉毒素暴露和重度飲酒等，我國(guó)乙肝患病率較高，HCC發(fā)病率具有增高趨勢(shì)［7］。目前HCC的治療主要包括手術(shù)切除、放化療和靶向治療，其中腫瘤切除和肝臟移植是早期肝癌的主要治療策略，但近40%的患者在肝切除術(shù)后的第一年內(nèi)復(fù)發(fā)，且肝臟移植來(lái)源困難［8］。晚期肝癌的治療主要取決于經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、放療、化學(xué)療法和索拉非尼的靶向治療，腫瘤細(xì)胞對(duì)于放化療及靶向藥物的抵抗性，仍然是不可攻克的難題［9］。HCC的高度侵襲性和治療方法的局限性促使HCC長(zhǎng)期預(yù)后仍然不能令人滿意［2］?？尚星矣行У闹委煼椒ㄊ荋CC的研究重點(diǎn)。目前HCC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。因此探索HCC進(jìn)展的詳細(xì)機(jī)制有助于確定HCC新的治療靶點(diǎn)。

短鏈醇脫氫酶∕還原酶（SDR）超家族參與多種中間代謝過(guò)程和脂質(zhì)信號(hào)分子代謝，結(jié)構(gòu)中含有一些常見(jiàn)的序列基序，如NAD∕NADP輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的甘氨酸共有序列，作為催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸和分布在序列之間高度保守的氨基酸序列，這些結(jié)構(gòu)使SDR酶在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要功能［10］。SDR酶超家族的成員SDR25C1，又稱DHRS2，位于染色體14q11.2，該區(qū)域在許多腫瘤中具有高頻雜合性缺失，在腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要功能［11］。DHRS2在奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中表達(dá)增加，而沉默DHRS2的表達(dá)可通過(guò)p53依賴性途徑有效地恢復(fù)奧沙利鉑的敏感性，抑制DHRS2的表達(dá)可能是預(yù)防結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥的有效策略［4］。鼻咽癌中DHRS2在體內(nèi)和體外抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可作為抗腫瘤藥物天花霉素的靶點(diǎn)治療鼻咽癌［5］。由此可見(jiàn)，DHRS2在不同類(lèi)型腫瘤中發(fā)揮的作用可能不一致，而DHRS2在HCC中的具體作用未知。本文采用TCGA和Kaplan meier plotter兩大數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出，DHRS2在HCC中表達(dá)下調(diào)，且DHRS2表達(dá)高的HCC患者具有較好的預(yù)后。與HAN等［6］報(bào)道的卵巢癌組織中DHRS2表達(dá)降低，卵巢癌患者中DHRS2的高表達(dá)與更好的預(yù)后相關(guān)結(jié)果一致。本文由于條件的限制，未在組織樣本上進(jìn)行分析，但在細(xì)胞水平上檢測(cè)了DHRS2的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示DHRS2蛋白在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)均低于在正常肝細(xì)胞系LO2中的表達(dá)，提示DHRS2在HCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

進(jìn)一步選擇HCC表達(dá)低的Huh-7細(xì)胞進(jìn)行DHRS2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，研究其在HCC中發(fā)揮的具體生物學(xué)功能。ZHOU等［11］報(bào)道DHRS2表達(dá)的下調(diào)與食管癌的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期晚期和患者預(yù)后較差有關(guān)，且體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)研究均表明，DHRS2可抑制食管癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。本文功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)DHRS2抑制HCC細(xì)胞的增殖活性、平板克隆形成和轉(zhuǎn)移能力，并使細(xì)胞阻滯在G2∕M期，其中細(xì)胞增殖活性、平板克隆形成能力和細(xì)胞周期均反映細(xì)胞的增殖能力，表明DHRS2在HCC中與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移惡性行為有關(guān)。Toll樣受體家族是重要的受體家族，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要功能，其家族成員TLR4介導(dǎo)的炎癥在宿主防御入侵病原體和對(duì)炎癥刺激的生理反應(yīng)中都至關(guān)重要，TLR4在慢性肝炎和肝硬化中增加，在HCC中維持高表達(dá)［12-14］。而MyD88是TLR4發(fā)揮作用的關(guān)鍵銜接分子，也是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子，其調(diào)控的下游分子參與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，在HCC中MyD88呈高表達(dá)狀態(tài)，TLR4∕MyD88信號(hào)通路是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要相關(guān)途徑［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)DHRS2抑制HCC細(xì)胞中TLR4和MyD88蛋白表達(dá)，表明DHRS2可能通過(guò)降低TLR4∕MyD88信號(hào)通路活性抑制HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，DHRS2在HCC中發(fā)揮抑癌基因功能，其可能通過(guò)調(diào)控TLR4∕MyD88信號(hào)通路活性抑制HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，DHRS2可能是治療HCC的新型有效治療靶標(biāo)。