血漿p16、ANXA-1抗體在非小細(xì)胞肺癌患者的表達(dá)變化及其作為診斷標(biāo)志物的探討

趙 歡 張 萱 韓志峰 馬小莉（青島大學(xué)附屬青島市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，青島266071）

哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的順利進(jìn)行得益于細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（cyclin-dependent protein kinase inhibitors，CKIs）的協(xié)同作用及平衡調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期中設(shè)有多個(gè)調(diào)控點(diǎn)以保障其順利有序進(jìn)行，其中，G1-S期是最為關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)。正常生理情況下，細(xì)胞分化增殖過(guò)程中，CyclinD1與CDK4、CDK6相互作用形成復(fù)合物，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化失活及轉(zhuǎn)錄因子E2F1釋放入核。進(jìn)入細(xì)胞核的E2F1與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)S期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。p16蛋白是G1晚期的負(fù)性調(diào)控因子，通過(guò)與CyclinD1蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4及CDK6抑制CDK4∕6介導(dǎo)的Rb蛋白磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G1期［1-2］。CyclinDl∕p16∕Rb信號(hào)傳導(dǎo)通路的任一環(huán)節(jié)異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。與多數(shù)正常組織微量表達(dá)或幾乎不表達(dá)不同，多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道了多種實(shí)體腫瘤內(nèi)p16蛋白過(guò)度表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生及其惡性生物學(xué)行為有關(guān)［3］。

膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1，ANXA-1）是鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白超家族成員，在調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化、凋亡細(xì)胞吞噬清除等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA-1在COPD及NSCLC中 表 達(dá) 上 調(diào)［5］。ANXA-1可 通 過(guò)ANXA-1∕NF-κB∕miR-26a信號(hào)通路增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞中核因子NF-κB活 化，促 進(jìn) 腫 瘤 侵 襲 與 轉(zhuǎn) 移［6］。敲 除ANXA-1基因可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲［4］。表明ANXA-1可能在NSCLC發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［7］。

腫瘤發(fā)生早期，異常表達(dá)的腫瘤抗原可被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，激活體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致相應(yīng)抗體產(chǎn)生，稱為腫瘤相關(guān)自身抗體（tumor associated autoantibody，TAAb）［8-9］。部分TAAb在臨床癥狀出現(xiàn)前即可在患者血液中檢測(cè)到，為尋找潛在腫瘤早期診斷標(biāo)志物提供依據(jù)。目前已在多種腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到p16、ANXA-1自身抗體，如肝細(xì)胞癌、乳腺癌、食管癌、宮頸癌［10-13］。NSCLC患者血漿中也檢測(cè)到p16、ANXA-1抗體，但p16、ANXA-1自身抗體能否作為肺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物尚未明確。本研究采用抗原表位預(yù)測(cè)工具設(shè)計(jì)、合成抗原多肽（p16a、p16b、ANXA-1），采用自行建立的優(yōu)化ELISA法檢測(cè)NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)情況，分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及其對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，以期為NSCLC診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2014年11月至2018年8月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科首次確診的NSCLC患者209例，男性131例，女性78例，年齡33～79歲，平均年齡58歲。根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。所有患者未接受過(guò)抗腫瘤治療（放化療或手術(shù)治療），且所有患者均經(jīng)手術(shù)切除肺組織病理學(xué)檢查確診。排除有惡性腫瘤家族史或合并其他腫瘤及患有自身免疫性疾病者。同時(shí)，選取同期健康志愿者193例作為正常對(duì)照組，男性103例，女性90例，年齡33～79歲，平均年齡58歲。根據(jù)病例資料，統(tǒng)計(jì)NSCLC組人口學(xué)信息，如年齡、性別、吸煙狀況，及臨床分期、病理類型、分化程度、腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理學(xué)信息。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬青島市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑 抗原肽委托上海吉爾生化有限公司合成；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；1.0 mol∕L磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖片、小牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；顯色劑、終止液購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 清晨、空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血5 ml，4℃、2 500 r∕min離心10 min，收集上層血漿進(jìn)行檢測(cè)，剩余血漿于-80℃保存。

1.2.2 抗原肽設(shè)計(jì)、合成 采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及表位預(yù)測(cè)軟件（http：∕∕www.iedb.org）設(shè)計(jì)抗原肽：對(duì)目標(biāo)蛋白p16、ANXA-1進(jìn)行序列分析，評(píng)估其pH值、親水性、柔性、抗原性、表面可及性等，根據(jù)每段序列與HLA-Ⅱ51個(gè)等位基因分子的結(jié)合力篩選目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)中潛在的T細(xì)胞表位，預(yù)測(cè)每段序列潛在的B細(xì)胞表位，評(píng)分，對(duì)滿足上述要求的抗原片段進(jìn)行綜合評(píng)估，并根據(jù)抗原設(shè)計(jì)的一般原則對(duì)抗原片段進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，如N段親水性氨基酸的添加以增加片段親水性等，最終設(shè)計(jì)并委托上海吉爾生化公司合成3條抗原肽，分別為p16a、p16b、ANXA-1，p16a、p16b來(lái)源于p16蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中包含不同B細(xì)胞表位，3條抗原肽序列信息見(jiàn)表1。

表1 抗原肽序列信息Tab.1 Sequences information of antigen peptides

1.2.3 ELISA法檢測(cè)p16、ANXA-1抗體 將抗原肽稀釋至工作濃度（20 μg∕ml），100 μl∕每孔，4℃孵育過(guò)夜，0.1%PBST洗板3次，200 μl∕孔加入半胱氨酸溶液（10 μg∕ml）室溫避光封閉1 h，洗板2次后放入40℃烘箱干燥2.5 h，4℃放置1周，按照課題組前期方法進(jìn)行抗體檢測(cè)［14-15］。0.1%PBST洗板2次，0.5%小牛血清白蛋白（BSA）1：100稀釋后每孔加入50 μl，室溫孵育1.5 h，洗板3次，加入用0.5%BSA 1∶25 000稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗50 μl，室溫孵育1 h。50 μl∕孔加入顯色劑，室溫避光反應(yīng)25 min，加入25 μl終止液終止反應(yīng)，15 min內(nèi)采用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)和620 nm參考波長(zhǎng)處吸光度（OD）。每板均設(shè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。所有樣本設(shè)復(fù)孔，以2孔測(cè)定值的平均值表示該樣本OD值。所有樣本重復(fù)測(cè)定2次，以2次OD值的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以特異性結(jié)合指數(shù)（SBR）表示血漿p16、ANXA-1抗體水平，SBR=（OD樣本-OD陰性對(duì)照）∕（OD陽(yáng)性對(duì)照-OD陰性對(duì)照）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，NSCLC組及健康對(duì)照組血漿p16、ANXA-1抗體水平及不同TNM分期NSCLC患者抗體表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用Student′st檢驗(yàn)。不同TNM分期NSCLC組抗體表達(dá)水平兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。NSCLC組及健康對(duì)照組性別、吸煙情況等比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Graphpad prism 5.0軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并分析p16、ANXA-1抗體對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，計(jì)算最佳截?cái)嘀?、靈敏度及特異度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組及健康對(duì)照組臨床資料比較NSCLC組包括腺癌124例，鱗癌85例（圖1）；如表2所示，TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。NSCLC組與健康對(duì)照組的性別、年齡、吸煙情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 NSCLC患者病理及免疫組化特征（HE染色，×40）Fig.1 Pathological and immunohistochemical features of NSCLC patients（HE staining，×40）

表2 NSCLC組及對(duì)照組臨床資料比較［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

表2 NSCLC組及對(duì)照組臨床資料比較［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Age（year）Gender Male Female Smoking history No Yes Histology SCC AC TNMⅠⅡⅢⅣNSCLC 58.6±8.7 131（62.7）78（37.3）103（49.3）106（50.7）85（40.7）124（59.3）20（9.6）100（47.8）40（19.1）49（23.5）Control 58.6±9.3 103（53.4）90（46.6）93（48.2）100（51.8）N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A χ2∕t-0.06 3.58 0.05 P 0.96 0.06 0.83

2.2 多組間血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)水平比較 如表3所示，NSCLC組血漿p16a抗體表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.001），且NSCLC患者早期（Ⅰ期）即出現(xiàn)p16a抗體表達(dá)增加，隨肺癌進(jìn)展，其表達(dá)水平逐漸升高。NSCLC患者血漿ANXA-1抗體表達(dá)較健康對(duì)照組顯著增加，且在Ⅱ～Ⅳ期患者中增加更為顯著（P＜0.05）。NSCLC組與健康對(duì)照組p16b抗體表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同TNM分期患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

表3 各組血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.001 vs Control group.

Groups Control NSCLCⅠⅡⅢⅣn 193 209 20 100 40 49 p16a IgG 0.53±0.17 0.75±0.182）0.69±0.232）0.73±0.182）0.77±0.142）0.78±0.182）p16b IgG 0.87±0.26 0.89±0.31 0.85±0.41 0.86±0.23 0.93±0.30 0.93±0.41 ANXA-1 IgG 1.01±0.48 1.17±0.482）1.17±0.60 1.16±0.501）1.17±0.431）1.20±0.441）

2.3 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析 如表4所示，鱗癌患者血漿p16a抗體表達(dá)水平顯著高于腺癌患者（P=0.02）。高分化患者血漿p16a抗體表達(dá)水平顯著低于低分化患者（P=0.03）。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血漿p16a、p16b抗體表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.03，P=0.03）。p16a抗體表達(dá)與病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，p16b抗體表達(dá)水平僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。NSCLC患者血漿ANXA-1抗體表達(dá)與年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

表4 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame?ters of NSCLC patients（±s，n=209）

表4 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame?ters of NSCLC patients（±s，n=209）

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Gender Male Female Age（year）≥60＜60 Smoking history Yes No Histology SCC AC Differentiation grade Well∕Moderate Poor pT 1～2 3～4 N Present Absent TNMⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn 131 78 104 105 98 111 85 124 102 107 205 4 102 107 120 89 p16a IgG 0.77±0.16 0.72±0.20 0.77±0.17 0.73±0.19 0.76±0.18 0.73±0.17 0.78±0.17 0.72±0.18 0.72±0.18 0.77±0.17 0.75±0.18 0.73±0.17 0.77±0.16 0.72±0.19 0.73±0.19 0.77±0.16 t 1.96-1.56-1.78-2.31 2.23 0.16-2.13-1.91 P 0.05 0.12 0.09 0.02 0.03 0.87 0.03 0.06 p16b IgG 0.89±0.29 0.89±0.36 0.92±0.35 0.86±0.27 0.90±0.31 0.88±0.25 0.91±0.33 0.87±0.30 0.87±0.29 0.91±0.33 0.89±0.31 1.00±0.49 0.94±0.35 0.84±0.26 0.86±0.27 0.93±0.36 t 0.34-1.43-1.03-0.84 0.99 0.71-2.26-1.75 P 0.74 0.16 0.23 0.40 0.32 0.48 0.03 0.08 ANXA-1 IgG 1.21±0.47 1.10±0.51 1.22±0.44 1.12±0.52 1.16±0.34 1.13±0.46 1.19±0.44 1.15±0.51 1.12±0.45 1.22±0.51 1.17±0.48 1.20±0.62 1.22±0.46 1.13±0.50 1.16±0.52 1.19±0.43 t 1.66-1.37-1.19-0.59 1.43-0.14-1.37-0.39 P 0.10 0.17 0.32 0.55 0.16 0.89 0.17 0.70

2.4 血漿p16抗體和ANXA-1抗體對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 采用ROC曲線評(píng)價(jià)血漿p16抗體和ANXA-1抗體對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，結(jié)果如圖2、表5所示，p16a抗體AUC為0.816（95%CI：0.774～0.857），截?cái)嘀禐?.61，診斷靈敏度為78%，特異度為75%。p16a抗體對(duì)Ⅰ期患者診斷的AUC為0.701（95%CI：0.575～0.828），診 斷 靈 敏 度 為55%，特異度為81%，提示p16a抗體對(duì)早期NSCLC有輔助診斷價(jià)值。p16a抗體對(duì)Ⅱ～Ⅳ期的診斷效能稍高于Ⅰ期，AUC分別為0.805、0.869、0.843，診斷靈敏度分別為77%、90%、74%，特異度分別為75%、75%、83%。ANXA-1抗 體AUC為0.614（95%CI：0.559～0.669），截?cái)嘀禐?.04，診斷靈敏度為57%，特異度為67%。p16b抗體AUC為0.502（95%CI：0.446～0.559），對(duì)NSCLC的診斷效能較差。

圖2 血漿p16、ANXA-1抗體診斷不同分期NSCLC的ROC曲線圖Fig.2 ROC curve of diagnostic value of p16 and ANXA-1 antibodies for different stages of NSCLC

表5 p16、ANXA-1抗體對(duì)不同分期NSCLC診斷效能的ROC曲線分析（%）Tab.5 ROC curve analysis of diagnostic efficacy of circu?lating antibodies against p16 and ANXA-1 in dif?ferent stages of NSCLC（%）

3 討論

作為機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答產(chǎn)物，雖然腫瘤相關(guān)自身抗體產(chǎn)生的機(jī)制尚未闡明，但大量研究表明其可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。QIU等［16］通過(guò)檢測(cè)肺癌診斷1年前患者血清中LAMR1自身抗體水平發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，且越接近疾病診斷時(shí)升高趨勢(shì)越為明顯。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，survivin抗體表達(dá)水平較高的NSCLC患者術(shù)后生存期較表達(dá)水平較低組顯著延長(zhǎng)，為從眾多腫瘤相關(guān)自身抗體中尋找可用于NSCLC早期診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)［15］。作為腫瘤標(biāo)志物，自身抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易被蛋白酶水解、可在血清穩(wěn)定存在較長(zhǎng)時(shí)間（半衰期7～30 d），并經(jīng)過(guò)免疫放大效應(yīng)，即使在腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAAs）濃度較低時(shí)仍可以高水平存在［17-18］。使自身抗體與其相應(yīng)的TAAs相比在作為癌癥早期診斷生物標(biāo)志物上更有優(yōu)勢(shì)。

作為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)基因，p16在多種實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等［19-22］。p16異常表達(dá)通常發(fā)生在腫瘤早期，為探索p16抗體作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的價(jià)值提供了有力依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，p16抗體對(duì)早期食管癌、宮頸癌有一定診斷價(jià)值［12，23］，但p16抗體對(duì)NSCLC早期診斷價(jià)值的研究結(jié)論尚未統(tǒng)一。ANXA-1分子具有抗炎活性，可通過(guò)抑制免疫細(xì)胞聚集、遷移及活性削弱機(jī)體免疫監(jiān)視功能，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。研究報(bào)道ANXA-1在COPD及NSCLC中表達(dá)上調(diào)。因此，本研究推測(cè)ANXA-1抗體可預(yù)測(cè)NSCLC發(fā)生。檢測(cè)NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血漿p16a、ANXA-1抗體表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，且隨肺癌進(jìn)展，兩者表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，推測(cè)p16a、ANXA-1抗體可能參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。NSCLC患者血漿p16a抗體過(guò)表達(dá)的機(jī)制尚未闡明，但大量證據(jù)表明p16a抗體過(guò)表達(dá)可能與p16Ink4a-Rb通路異常有關(guān)。Rb蛋白可負(fù)反饋調(diào)節(jié)p16基因表達(dá)，腫瘤發(fā)生通常伴隨Rb蛋白表達(dá)缺失，導(dǎo)致p16基因過(guò)表達(dá)。p16基因過(guò)表達(dá)可能是機(jī)體抗腫瘤的方式，機(jī)體試圖通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖抑制肺癌進(jìn)展，但效果較差［24］。p16a、ANXA-1抗體在NSCLC患者血漿的表達(dá)有明顯差異，ANXA-1抗體在Ⅱ～Ⅳ期而非Ⅰ期患者中表達(dá)增加，提示ANXA-1可能主要在NSCLC中晚期而非早期發(fā)揮作用。ANXA-1對(duì)NSCLC預(yù)后的影響及分子機(jī)制目前鮮有報(bào)道，仍需大規(guī)?；仡櫺匝芯窟M(jìn)一步闡明。p16a在Ⅰ期NSCLC患者中表達(dá)增加，提示p16a可能參與NSCLC發(fā)生，有望成為NSCLC早期診斷的生物標(biāo)志物。采用ROC曲線分析p16、ANXA-1抗體對(duì)不同TNM分期診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，p16a抗體診斷Ⅰ期NSCLC患者的AUC為0.701，敏感度為81%，提示其對(duì)早期肺癌有一定診斷價(jià)值；低分化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血漿p16a抗體表達(dá)水平顯著高于高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示p16a抗體可能對(duì)NSCLC預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且p16a抗體對(duì)Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的診斷效能優(yōu)于Ⅰ期，因此，p16a有望成為NSCLC分期預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。另外，p16a抗體的表達(dá)模式可能具有腫瘤特異性。JIN等［12］發(fā)現(xiàn)隨食管癌進(jìn)展，p16a抗體表達(dá)逐漸減弱，與p16a抗體在NSCLC中的表達(dá)趨勢(shì)相反。由于p16在多種實(shí)體腫瘤中均存在表達(dá)異常，仍需進(jìn)一步探索p16a抗體在其他實(shí)體腫瘤中的表達(dá)變化，以明確p16抗體對(duì)NSCLC的診斷是否具有特異性。本研究為病例對(duì)照研究，Ⅰ期患者樣本量相對(duì)較小，故研究結(jié)論存在一定局限性；此外，p16a、ANXA-1抗體參與NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

與重組蛋白相比，線性抗原肽具有非特異性結(jié)合少、表位特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，且造價(jià)低廉、檢測(cè)技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)便，適用于肺癌高危人群篩查。本研究根據(jù)p16分子中2個(gè)不同抗原表位分別設(shè)計(jì)了p16a和p16b 2個(gè)抗原肽，通過(guò)檢測(cè)NSCLC患者血漿p16a、p16b抗體表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，兩者在NSCLC血漿的表達(dá)趨勢(shì)截然不同：p16a抗體在NSCLC組表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，而p16b抗體表達(dá)與健康對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同抗原表位的免疫原性不同，與MHC分子結(jié)合后激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力也不同［25］。p16a抗原肽所含的抗原表位是觸發(fā)體液免疫應(yīng)答、導(dǎo)致p16抗體產(chǎn)生的真正原因，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更靈敏的抗體檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，p16、ANXA-1抗體在NSCLC中的表達(dá)變化提示其可能參與NSCLC發(fā)病機(jī)制。p16a抗體在NSCLC患者血漿過(guò)表達(dá)，且隨肺癌進(jìn)展表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示p16a抗體對(duì)NSCLC早期診斷、分期預(yù)測(cè)有一定價(jià)值。此外，p16a抗體表達(dá)與病理類型、腫瘤的低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示p16a抗體或許與NSCLC預(yù)后有關(guān)，但仍需大規(guī)模回顧性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。