玉米半乳糖代謝相關(guān)酶蛋白基因的克隆及表達(dá)

楊海鵬， 曹 丹， 劉小紅， 陳 偉， 張紅梅， 劉婭娟

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所， 山西 忻州 034000；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 四川 南充637000)

玉米(ZeamaysL.)是世界上最主要的三大禾谷類作物之一，起源于中美洲和南美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)的高地，適宜于較溫暖的環(huán)境。雖然光照、溫度、水分、CO2等生態(tài)條件對(duì)玉米生長(zhǎng)都有影響，但溫度始終是影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一[1]。近年來(lái)，隨著全球氣溫的升高及極端高溫天氣的頻發(fā)，高溫已成為限制作物生產(chǎn)的重要非生物脅迫因子之一。高溫脅迫會(huì)影響玉米開花、授粉和籽粒灌漿，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降，從而降低玉米產(chǎn)量。因此，高溫對(duì)玉米生產(chǎn)的不利影響越來(lái)越受到關(guān)注。

玉米開花散粉期，在中國(guó)黃淮海地區(qū)、西南部分地區(qū)特別容易遭遇高溫天氣，導(dǎo)致玉米花粉活力下降，嚴(yán)重影響玉米的受精結(jié)實(shí)，玉米產(chǎn)量大幅下降[2]。但是，不同玉米品種對(duì)高溫天氣的耐受性存在差異[3]，當(dāng)前絕大多數(shù)品種都不耐高溫，但經(jīng)過育種家們的努力，現(xiàn)也選育出少量耐高溫的玉米品種，如中地88，在散粉期遭遇42 ℃的高溫，其花粉活力幾乎不受影響。因此，研究玉米花粉耐高溫脅迫的分子遺傳機(jī)制具有重要意義。

半乳糖是動(dòng)植物體內(nèi)一種重要的單糖，主要由乳糖分解而來(lái)，可以經(jīng)一系列代謝步聚轉(zhuǎn)換成葡萄糖、果糖或其他小分子物質(zhì)，從而被細(xì)胞吸收利用[4]。體內(nèi)的半乳糖代謝具有非常復(fù)雜的通路，涉及許多的酶和其他小分子輔助物參與。其中，ATP依賴的6-磷酸果糖激酶(ATP-dependent 6-phosphofructokinase,ATP-PFK)、半乳糖異構(gòu)酶(galactose mutarotase,GalM)和己糖激酶(hexokinase,HXK)等都是在半乳糖代謝通路中的重要酶蛋白。這些酶除參與半乳糖代謝外，還具有很多其他的生物學(xué)功能[5-6]，如HXK在糖酵解途徑中，是糖氧化反應(yīng)過程的限速酶或稱關(guān)鍵酶[7]。因此，克隆分析這些酶蛋白基因具有重要的生物學(xué)意義。

基因差異表達(dá)分析是克隆耐逆境脅迫基因的重要手段，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序又是實(shí)現(xiàn)這一目的的強(qiáng)大工具[8-10]。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物物種發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，包括水稻[11-12]、玉米[13-14]、小麥[15-16]、大豆[17]、大麥[18]、高梁[19]、棉花[20]等。基于此，本研究借助轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)，以高溫環(huán)境下具有不同耐高溫脅迫能力的玉米品種的花粉為材料，對(duì)ATP依賴的6-磷酸果糖激酶基因、半乳糖異構(gòu)酶基因和己糖激酶基因進(jìn)行了克隆測(cè)序分析，并進(jìn)一步對(duì)這幾個(gè)基因在花粉細(xì)胞中的差異表達(dá)及酶參與的半乳糖代謝通路進(jìn)行詳細(xì)分析，以了解這些基因和表達(dá)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為玉米其他代謝通路的類似研究提供分子參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為中地88(耐高溫脅迫)和先玉335(不耐高溫脅迫)兩個(gè)玉米品種。

1.2 方 法

1.2.1玉米半乳糖代謝相關(guān)基因的克隆

在42 ℃高溫的田間大棚里取2個(gè)材料的花粉，每個(gè)材料設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果文件中搜索得到與玉米半乳糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因的序列信息。

1.2.2基因及蛋白的生物信息學(xué)分析

基因的編碼信息及表達(dá)蛋白的生物學(xué)特性由網(wǎng)絡(luò)在線工具分析完成，具體包括：

1)開放閱讀框https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/；序列同源比對(duì)：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/；

2)蛋白理化性質(zhì)：https://web.expasy.org/protparam/；

3)蛋白功能位點(diǎn)：https://prosite.expasy.org/；

4)蛋白結(jié)構(gòu)：①保守結(jié)構(gòu)域：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/；②二級(jí)結(jié)構(gòu)：http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/；③三級(jí)結(jié)構(gòu)：https://www.swissmodel.expasy.org/。

1.2.3基因的差異表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)半乳糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括五個(gè)參數(shù)：

1)平均表達(dá)量：進(jìn)行差異比較的兩組全部樣品該基因read count的均一化結(jié)果；

2)對(duì)照表達(dá)量：對(duì)照組全部樣品該基因read count的均一化結(jié)果；

3)處理表達(dá)量：處理組全部樣品該基因read count的均一化結(jié)果；

4)差異倍數(shù)：在基因的兩組表達(dá)量，較大值與較小值之比；

5)顯著性p值：差異顯著性統(tǒng)計(jì)值。

1.2.4半乳糖代謝通路分析

利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)工具分析本試驗(yàn)中與半乳糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)的酶蛋白在代謝通路中所處位置，分析酶催化的化學(xué)反應(yīng)中的底物和產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

通過對(duì)中地88和先玉米335的花粉細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了4個(gè)與玉米半乳糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，包括2個(gè)ATP-PFK基因(zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2)，1個(gè)GalM基因(zm-zx-gm)和1個(gè)HXK基因(zm-zx-hxk)。這4個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)分別為2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都為斷裂基因，含有大量?jī)?nèi)含子序列，分別位于第6、6、2號(hào)和3號(hào)染色體上。

2.2 基因編碼蛋白分析

2.2.1開放閱讀框和同源比對(duì)分析

對(duì)半乳糖代謝相關(guān)的4個(gè)基因編碼蛋白的開放閱讀框進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1～圖4所示。zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因全長(zhǎng)為348個(gè)、288個(gè)、370個(gè)和407個(gè)，都含有20種不同氨基酸，帶負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)含量分別為：49、31、34、54，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)含量分別為：38、33、34、42。

利用NCBI網(wǎng)站的Protein Blast工具對(duì)這4個(gè)基因的編碼蛋白作同源性搜索，結(jié)果顯示，zm-zx-pfk1基因與玉米、高粱(Sorghumbicolor)和甘蔗(Saccharumofficinarum)的ATP-PFK基因的一致性分別為100%(XP_008649908.1)、95.45%(OQU 78332.1)和96.56%(AWA 44824.1)；zm-zx-pfk2基因與玉米、高粱和甘蔗的ATP-PFK基因的一致性分別為100%(AQK 87784.1 AQK 80438.1)、91.79%(XP_002437847.1)和93.28%(AGT16840.1)；zm-zx-gm基因與玉米GalM基因的一致性為100%(ONM 16962.1 AQK 80438.1)，與玉米、高粱和小米(Setariaitalica)的醛糖-1-異構(gòu)酶基因的一致性分別為98.66%(PWZ 38696.1)、87.50%(XP_002446609.1)和82.09%(XP_004975841.1)；zm-zx-hxk基因與玉米、小米和高粱的HXK基因的一致性分別為95.90%(ONM 38338.1AQK 80438.1)、92.09%(XP_004969912.1)和79.31%(XP_002458467.1)。

2.2.2理化性質(zhì)分析

對(duì)玉米半乳糖代謝相關(guān)的4個(gè)基因的理化性質(zhì)利用在線工具ProtParam進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表1所示。這4個(gè)基因的分子量都較大，其分子量大小與所含氨基酸數(shù)量呈正相關(guān)；從等電點(diǎn)可以看出，zm-zx-pfk1和zm-zx-hxk顯酸性，而zm-zx-pfk2和zm-zx-gm顯堿性；從不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和平均親水系數(shù)可以看出，這4個(gè)基因的編碼蛋白均屬穩(wěn)定親水性蛋白。

表1 玉米半乳糖代謝相關(guān)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

此外，還對(duì)這4個(gè)基因的編碼蛋白利用網(wǎng)絡(luò)在線工具NetPhos 3.1作了磷酸化修飾分析，結(jié)果表明，m-zx-pfk1基因編碼蛋白含有17個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和8個(gè)酪氨酸位點(diǎn)；zm-zx-pfk2基因編碼蛋白含有9個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、10個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)；zm-zx-gm基因含有13個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、14個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸位點(diǎn)；zm-zx-hxk基因編碼蛋白含有15個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、10個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和6個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

2.2.3功能位點(diǎn)分析

利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Prosite對(duì)半乳糖代謝相關(guān)的4個(gè)基因的編碼蛋白的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，含有的功能位點(diǎn)種類、數(shù)量及在氨基酸序列中的位點(diǎn)見表2。在這5種功能位點(diǎn)中，zm-zx-pfk2基因編碼蛋白最少，只含有3種(2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和8個(gè)cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn))；zm-zx-pfk1基因編碼蛋白有4種(10個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn))；zm-zx-gm基因編碼蛋白也含有同樣的4種(9個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn))；zm-zx-hxk基因編碼蛋白含有的功能位點(diǎn)種類最多，包含了全部5種(11個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn))。

表2 玉米半乳糖代謝相關(guān)基因編碼蛋白的功能位點(diǎn)

2.2.4結(jié)構(gòu)分析

利用保守結(jié)構(gòu)域在線工具Conserved Domains對(duì)zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因編碼蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分別含有磷酸果糖激酶結(jié)構(gòu)域(85-348)、磷酸果糖激酶結(jié)構(gòu)域(62-261)、醛糖-1-異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域(27-369)和己糖激酶結(jié)構(gòu)域(2-405)。半乳糖異構(gòu)酶屬于醛糖-1-異構(gòu)酶。

對(duì)4個(gè)基因表達(dá)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Psipred進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，zm-zx-pfk1基因編碼蛋白有12個(gè)螺旋區(qū)，12個(gè)折疊區(qū)；zm-zx-pfk2基因有6個(gè)螺旋區(qū)，11個(gè)折疊區(qū)；zm-zx-gm基因編碼蛋白有5個(gè)螺旋區(qū)，23個(gè)折疊區(qū)；zm-zx-hxk基因編碼蛋白有13個(gè)螺旋區(qū)，12個(gè)折疊區(qū)。除螺旋區(qū)和折疊區(qū)外，這4個(gè)基因都含有大量無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)。

對(duì)4個(gè)基因表達(dá)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)利用網(wǎng)絡(luò)在線工具SWISS-MODEL分析完成，zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因編碼蛋白的模型1的參照模板分別為6 qu 5.1.A、6 qu 3.1.A、1 snz.1.A和6 jj7.1.A，其對(duì)蛋白名稱的描述與保守結(jié)構(gòu)域在線分析結(jié)果完全一致。

2.3 基因表達(dá)分析

本試驗(yàn)中克隆的4個(gè)半乳糖代謝相關(guān)基因在中地88(處理)和先玉335(對(duì)照)兩個(gè)玉米材料中的表達(dá)情況作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，這4個(gè)基因的表達(dá)均呈極顯著差異，其中zm-zx-pfk1基因上調(diào)表達(dá)，其差異倍數(shù)高達(dá)26.19；zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk三個(gè)基因表現(xiàn)相反，為下調(diào)表達(dá)，其差異倍數(shù)分別達(dá)到2.86、3.94倍和2.64倍。

表3 玉米半乳糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)統(tǒng)計(jì)

2.4 代謝通路分析

本試驗(yàn)中的這4個(gè)基因編碼蛋白都參與了半乳糖代謝，在半乳糖代謝通路中所處位置如圖5所示。在通路2.7.1.11(紫色)位置包括了zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2兩個(gè)基因的編碼蛋白，這兩個(gè)基因表達(dá)模式相反，其中zm-zx-pfk1為上調(diào)表達(dá)基因，而zm-zx-pfk2為下調(diào)表達(dá)基因，這兩個(gè)基因都表達(dá)ATP依賴的6-磷酸果糖激酶，雖然這兩個(gè)基因表達(dá)的蛋白不同，但都處在這個(gè)通路位置，具有相同的功能，都是促進(jìn)D-塔格糖-1,6-二磷酸(D-Tagatose-1,6 P 2)與D-塔格糖-6磷酸(D-Tagatose-6 P)的相互轉(zhuǎn)化。在5.1.3.3(綠色)位置包括了zm-zx-gm基因的編碼蛋白，該基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)基因，表達(dá)的半乳糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖(D-Galactose)轉(zhuǎn)化為α-D-半乳糖(α-D-Galactose)。在2.7.1.11(綠色)位置包括了zm-zx-hxk基因的編碼蛋白，這個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)基因，表達(dá)的己糖激酶催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)和α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)相互轉(zhuǎn)化。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

在半乳糖代謝的KEGG通路中，D-半乳糖通過Leloir途徑產(chǎn)生更有利于代謝利用的D-葡萄糖-1-磷酸，在這個(gè)過程中，需要多個(gè)酶參與，其中GalM是第一步需要的酶。關(guān)于半乳糖異構(gòu)酶已有一些研究，如Scott A等[21]從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中鑒定了一個(gè)GalM，并對(duì)其生物學(xué)活性作了一些鑒定。本試驗(yàn)在玉米中鑒定的zm-zx-gm基因就可以表達(dá)GalM，該酶可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?D-半乳糖，α-D-半乳糖再進(jìn)一步在半乳糖激酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?D-半乳糖-1-磷酸?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示，zm-zx-gm基因在先玉335(ck)花粉中的表達(dá)量較高，而在中地88花粉中表達(dá)量較低，為下調(diào)表達(dá)，其差異倍數(shù)達(dá)到3.94倍。

ATP-PFK可以在有ATP提供磷酸基的情況下，催化果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-1,6-二磷酸，該酶目前已在細(xì)菌和一些真核生物中被鑒定[22-24]，如Hansen等[25]鑒定了一個(gè)來(lái)自嗜熱細(xì)菌海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的ATP-PFK，大小為140 kDa，是一個(gè)同源四聚體蛋白，單個(gè)亞基為34 kDa，ATP-PFK是經(jīng)典Embden-Meyerhof途徑糖酵解的關(guān)鍵酶之一[26]。在本試驗(yàn)中，zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2兩個(gè)基因的ATP-PFK表達(dá)物在KEGG通路中，參與了半乳糖代謝，其功能是催化D-塔格糖-6磷酸轉(zhuǎn)化為D-塔格糖-1,6-二磷酸(塔格糖是果糖的一種異構(gòu)物)，但這兩個(gè)基因的表達(dá)物是不同的依賴于ATP的6-磷酸果糖激酶，zm-zx-pfk1基因表達(dá)蛋白分子量較大，pH值小于7，呈酸性，而zm-zx-pfk2基因的表達(dá)蛋白分子量較小，但pH值要大得多，呈堿性。在玉米花粉細(xì)胞中，zm-zx-pfk1基因上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)超過26倍，zm-zx-pfk2則相反，為下調(diào)表達(dá)，但差異倍數(shù)僅有2.86倍。

HXK在植物中是唯一能磷酸化修飾葡萄糖的一種激酶，同時(shí)還能磷酸化修飾果糖[27-28]，除了其催化磷酸化活性外，HXK還有其他一些生物學(xué)活性[29]，如可以作為糖傳感器發(fā)揮作用，而不依賴于其磷酸化活性[5]；可以感知葡萄糖和果糖的水平，并產(chǎn)生激活關(guān)閉氣孔的脫落酸(ABA)途徑的信號(hào)[30]。本研究中，zm-zx-hxk基因表達(dá)的HXK在半乳糖代謝的KEGG通路中，具有一樣的活性，可以催化α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為α-D-葡萄糖-6-磷酸，使得α-D-葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，從而被代謝利用。但是這個(gè)基因在不同玉米材料中呈現(xiàn)差異表達(dá)，本試驗(yàn)中，在先玉335中表達(dá)量明顯高于中地88，其差異倍數(shù)達(dá)到了2.64倍。

上述4種酶都是KEGG半乳糖代謝通路中非常重要的酶，本試驗(yàn)在高溫脅迫條件下，對(duì)玉米花粉細(xì)胞中的這4個(gè)酶基因的結(jié)構(gòu)和差異表達(dá)作了相關(guān)分析，為進(jìn)一步的基因克隆及功能分析提供了分子基礎(chǔ)。這4個(gè)基因的表達(dá)與玉米耐受高溫脅迫的關(guān)系，以及玉米細(xì)胞中相關(guān)酶蛋白的純化及功能鑒定尚需進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié) 論

本研究以耐高溫脅迫差異明顯的兩個(gè)玉米品種材料，在高溫環(huán)境對(duì)其花粉細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，克隆得到4個(gè)與半乳糖代謝相關(guān)的基因(zm-zx-gm、zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2和zm-zx-hxk)，并對(duì)這幾個(gè)基因作了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析，結(jié)果如下：

1)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：這4基因全長(zhǎng)分別為2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都為斷裂基因，含有大量?jī)?nèi)含子序列，分別位于第6、6、2號(hào)和3號(hào)染色體上。其開放閱讀框分別可以編碼348、288、370個(gè)和407個(gè)氨基酸。并進(jìn)一步對(duì)其編碼的蛋白的理化性質(zhì)、功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)作了分析，所有這些結(jié)果都顯示，zm-zx-gm基因編碼半乳糖異構(gòu)酶；zm-zx-pfk1基因和zm-zx-pfk2基因編碼不同的磷酸果糖激酶；zm-zx-hxk基因編碼己糖激酶。

2)基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，這4個(gè)基因在兩個(gè)玉米花粉細(xì)胞中呈現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，以高溫敏感材料先玉335為對(duì)照，在處理材料中地88中，zm-zx-pfk1基因上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)高達(dá)26.19倍，zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk3個(gè)基因則相反，為下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別為2.86，3.94倍和2.64倍。

3)KEGG通路分析結(jié)果表明，這4個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物都參與了半乳糖代謝，zm-zx-gm基因產(chǎn)物催化D-半乳糖(D-Galactose)轉(zhuǎn)化為α-D-半乳糖(α-D-Galactose)；zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2基因產(chǎn)物都是促進(jìn)D-塔格糖-6磷酸轉(zhuǎn)化為D-塔格糖-1,6-二磷酸，但反應(yīng)是可逆的；zm-zx-hxk基因產(chǎn)物表達(dá)催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)轉(zhuǎn)化為α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)，該反應(yīng)也可逆。

本試驗(yàn)結(jié)果豐富了玉米細(xì)胞中半乳糖代謝途徑中的基因和酶蛋白信息，為進(jìn)一步酶的純化及功能分析奠定了分子基礎(chǔ)，也為其他植物的類似研究提供了參考。