肉桂種子生物學特性及生活力研究

鐘 磊， 錢家萍， 蔡啟忠， 王 敏， 張慧曄， 楊 全， 羅 碧

(1.廣東藥科大學中藥學院， 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產與開發(fā)重點研究室，國家中藥材產業(yè)技術體系廣州綜合試驗站，廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術研究中心， 廣州 510006；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司， 廣州 510006)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)又名桂，為樟科樟屬常綠喬木，主產于廣東、廣西、云南等地區(qū)，干燥樹皮(桂皮)、小枝(桂枝)、果實(桂子)均可入藥[1]，桂皮具有補火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經脈的功效[2]。肉桂的繁殖方式有種子繁殖、萌蘗繁殖和扦插繁殖，其中種子繁殖得到的肉桂幼苗根系發(fā)達、生命力頑強。肉桂種子屬于頑拗性種子[3]，具有脫水敏感性，即種子含水量低于某個臨界點時，種子活力會迅速喪失，保存難度大，只能隨采隨播[4]，因此對肉桂種子研究較少。大田育苗為傳統(tǒng)的肉桂育種方式，但發(fā)芽率并不高。前人對肉桂種子催芽方式進行了研究，彭壽強等[5]研究發(fā)現，水洗催芽的肉桂種子發(fā)芽率顯著高于沙藏催芽。李開祥等[6]發(fā)現，適當濃度GA3浸泡后的肉桂種子發(fā)芽率明顯高于對照，且在18～20 d發(fā)芽率最高，達到90%。

隨著肉桂產業(yè)的不斷發(fā)展，人工栽培面積的不斷擴大[7]，肉桂種子成為了種苗繁育最基本最重要的生產資料，而通過發(fā)芽率評價肉桂種子的質量存在時間長、檢驗難度大的問題。種子生活力測定能快速鑒定種子發(fā)芽能力，預測種子在發(fā)芽和出苗時的活力，是種子質量檢測的重要方式之一。雷慧霞等[8]通過正交試驗設計確定了TTC法快速測定白鮮種子的最佳條件。馬洪娜等[9]通過響應面分析法優(yōu)化了TTC法測定山豆根根種子生活力條件，且實驗結果與正交試驗和單因素試驗結果一致。目前對肉桂種子的貯藏方式、苗木繁育、栽培方法等方面有所研究，但未見對肉桂種子生物學特性及生活力測定研究。本實驗對肉桂種子形態(tài)特征、千粒重、含水量、萌發(fā)特性、生活力測定等方面進行研究，以期找到較高發(fā)芽率的種子萌發(fā)方法及最佳的生活力測定條件，為肉桂種子質量控制和種苗繁育技術研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019年3月至4月，采集廣東云浮市羅定市榃濱鎮(zhèn)(22°48′43″N，111°24′16″E)三十生肉桂母樹的成熟肉桂種子作為試驗材料，經廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)植物種子。

1.2 方 法

1.2.1外觀形態(tài)觀察

將采摘回來的肉桂種子去掉果皮，觀察并描述種子的顏色、形狀、質地等外觀形態(tài)。隨機取30粒種子，用游標卡尺(精密度0.01 mm)測量肉桂種子長度和直徑，并記錄數據。

1.2.2千粒重和含水量的測定

根據(GB/T 3543.7-1995)《農作物種子檢驗規(guī)程》[10]，采用千粒重法測定肉桂種子的千粒重。根據(GB 2772-1999)《林木種子檢驗規(guī)程》[11]測定肉桂種子含水量。

1.2.3不同萌發(fā)方式對肉桂種子發(fā)芽率的影響

設計4個萌發(fā)方式處理，分別為培養(yǎng)皿萌發(fā)、水洗催芽法、濕沙萌發(fā)、干沙萌發(fā)，每隔5 d統(tǒng)計發(fā)芽數，每個處理3次重復。

1.2.4種子生活力測定的正交試驗設計

根據《國際種子檢驗規(guī)程》[12]，采用三苯基氯化四氮唑(TTC)法測定肉桂種子生活力。為確定肉桂種子生活力測定的最佳條件，本實驗采用三因素三水平的正交試驗L9(33)設計法比較TTC濃度、染色溫度和染色時間等因素對種子生活力的影響(表1)。

表1 TTC測定因素和測定水平

1.2.5種子的預處理和生活力判斷

取50粒肉桂種子，用蒸餾水浸泡6 h，使種子充分吸水，用濾紙吸干表面的水分，并沿種子長軸縱向切開成兩半，使其胚露出，然后將種子置于裝有TTC溶液的棕色瓶中，放置在已設定好溫度的水浴箱中染色。每個處理重復3次。

肉桂種子生活力的判斷標準參照《國際種子檢驗規(guī)程》[12]，胚的主要組織染成粉紅色或紅色即為有活力的種子，按以下公式計算種子生活力：

種子生活力(%)=(染色數目/種子數目)×100%。

1.3 數據分析

使用Excel 2016軟件、SPSS 23.0軟件進行數據分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 種子形態(tài)特征

成熟的肉桂種子呈紫黑色，卵形至長卵形，種皮堅硬，表面光滑且具有蠟質光澤，種柄延伸方向有8～13條突起的棱；種子長度為7.91～12.78 mm，直徑為6.34～7.67 mm。肉桂種子千粒重平均值為262.41 g，標準差為1.73，變異系數(CV)為0.007；種子含水率平均值為35.99%，標準差為2.67，變異系數為0.074(表2)。

表2 肉桂種子千粒重及含水量

2.2 不同萌發(fā)方式對肉桂種子發(fā)芽率的影響

不同萌發(fā)方式對肉桂種子發(fā)芽率的影響如圖1所示，培養(yǎng)皿萌發(fā)、水洗催芽和濕沙萌發(fā)這3種萌發(fā)方式的大部分肉桂種子均在前15 d發(fā)芽，其中在濕沙條件下發(fā)芽率最高，為76.67%，培養(yǎng)皿萌發(fā)和水洗催芽條件下的萌發(fā)率分別為68.67%和51.2%，干沙條件下的肉桂種子幾乎不發(fā)芽。

2.3 肉桂種子生活力測定結果

由表3可見，肉桂種子生活力最高為98.67%，對應的染色條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時間為8 h，此條件下大部分肉桂種子的胚或胚根均被染成紅色或粉紅色；種子生活力最低為23.33%，對應的染色條件為0.1%、染色溫度為25 ℃、染色時間為4 h，此條件下肉桂種子胚或胚根大部分未被染色。

2.4 極差分析

由表3可見，TTC濃度的極差值最大，R=48.889，染色時間的極差最小，R=13.333。因此影響肉桂種子生活力的因素主次為TTC濃度>染色溫度>染色時間，即在染色時TTC濃度和染色溫度為主要影響因素，而染色時間對其影響相對較小。

表3 正交實驗TTC法測定肉桂種子生活力

2.5 方差分析

進一步對數據進行方差分析(表4)，可以看出，試驗中3個因素對試驗結果都具有極顯著差異(p<0.01)，說明TTC濃度和染色溫度是肉桂種子活力測定的重要因素。

比較各因素不同水平下肉桂種子生活力平均值(表5)，TTC濃度、染色溫度和染色時間在第3水平下的平均種子生活力是最大的，分別為85.78%、79.11%和73.78%。且各因素下不同水平之間的平均種子生活力差異顯著(p<0.05)。因此肉桂種子生活力測定條件初步認為TTC濃度為1%，染色溫度為35 ℃，染色時間為12 h。

表5 各因素不同水平肉桂種子生活力平均值比較

2.6 肉桂種子生活力測定適宜條件驗證

對正交試驗中未出現TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時間為12 h的試驗組進行染色條件驗證，結果如表6所示。種子平均生活力為96.67%，較方差實驗的第9組低，且染色時間較長。因此肉桂種子生活力測定條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時間為8 h。

表6 肉桂種子生活力的驗證

3 結果與討論

3.1 種子形態(tài)特征和萌發(fā)特性

肉桂成熟種子呈紫黑色，卵形或長卵形，種皮堅硬，種柄延伸方向有8～13條突起的棱；種子長7.91～12.78 mm，直徑6.34～7.67 mm，千粒重平均值為262.41 g，種子含水量平均值為35.99%。肉桂種子成熟時，種皮的顏色由紫黑色轉為黑褐色，萌發(fā)時種子頂端稍微裂開，胚根露出。本研究結果表明，不同萌發(fā)環(huán)境對肉桂種子萌發(fā)率有很大的影響，發(fā)芽率順序為濕沙萌發(fā)>培養(yǎng)皿萌發(fā)>水洗催芽>干沙萌發(fā)。田云等[13]發(fā)現，姜黃種子在濕沙條件下的萌發(fā)效果較濾紙培養(yǎng)皿。本研究結果與之一致，說明濕沙能較好保持種子的含水量，有利于種子萌發(fā)。而通過水洗催芽技術發(fā)現，肉桂種子的萌發(fā)效果比較差，在操作過程中發(fā)現種子表面極易霉變且種皮易破，這與彭壽強等[5]研究結果不一致，原因可能是在陰涼通風處放置時種子表面的水分容易蒸發(fā)，且與發(fā)芽床中溫度相比，較大的室溫變化會影響種子的萌發(fā)。

3.2 TTC法測定肉桂種子生活力的最佳條件

種子質量是藥材產量和品質的重要基礎和前提，而種子發(fā)芽率是檢測種子質量的重要指標之一[14]。通過種子發(fā)芽率來判斷肉桂種子的質量過程較長，許勇等[15]研究表明，肉桂種子播種后至少需要30 d基本發(fā)芽；李開祥等[6]研究發(fā)現，在GA3浸種下的肉桂種子萌發(fā)率雖然得到了顯著的提高，并縮短發(fā)芽時間。TTC法檢測種子生活力是一種能快速判斷種子萌發(fā)潛力和質量的有效方法，現已在多種藥用植物種子質量檢測中廣泛運用[16]，但不同植物種子的TTC法最佳測定條件不同，如明孟碟等[17]采用TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳條件為0.2%TTC溶液避光染色11～13 h，劉雅嵐等[18]通過TTC染色法分別確定了欖仁樹、水黃皮、銀合歡、見血封喉、黃槿等5種熱帶林木的種子生活力，結果表明，各種種子的染色溫度、染色時間和TTC濃度均不相同。本試驗中，正交設計組合9中的肉桂種子生活力達到98.67%，為正交試驗中最佳的染色條件，即肉桂種子在35 ℃條件下浸泡在1% TTC溶液避光染色8 h。雖然通過數據方差分析初定肉桂種子在35 ℃條件下1%的TTC溶液避光染色12 h為較優(yōu)方案，但是該方案與組合9比較，染色時間較長，且染色效果不及組合9。極差分析表明，TTC濃度和染色溫度是影響肉桂種子生活力的較重要的因素，而染色時間對生活力的測定影響較小，因此處理9可以作為最優(yōu)組合。綜上所述，肉桂種子生活力測定的最佳條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時間為8 h。

3.3 TTC法測定肉桂種子生活力的可行性

相關研究表明，通過TTC法測定種子生活力的結果一般大于或等于發(fā)芽率。羅光明等[19]研究發(fā)現，TTC染色法測定的車前子種子生活力與發(fā)芽率呈顯著的正相關。鐘淑梅等[20]研究發(fā)現，獨活種子生活力顯著高于發(fā)芽率，且兩者之間呈極顯著相關性；彭云霞等[21]研究發(fā)現，小葉黑柴胡種子生活力和發(fā)芽率具有明顯的線性關系。本研究中肉桂種子生活力最高為98.67%，發(fā)芽率為76.67%，種子的生活力高于發(fā)芽率，這可能是因為種皮含有萌發(fā)抑制物導致了種子休眠。杜會聰等[22]研究表明，臘梅種子的種仁和種皮中的萌發(fā)抑制物能顯著抑制白菜種子的萌發(fā)及芽和根的生長。李詢等[23]研究表明，多花黃精種子種皮中含有較多的萌發(fā)抑制物，具有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的作用。同時因為肉桂種子含多油性物質且易失活的特點，因此萌發(fā)環(huán)境對種子的發(fā)芽率影響也很大。本研究通過TTC法測定肉桂種子生活力需要8 h，而通過萌發(fā)實驗測定肉桂種子發(fā)芽率則需要至少15 d。因此在實際生產中可先采用TTC法測定肉桂種子的生活力來判斷肉桂種子潛在的發(fā)芽能力并了解種子的質量。