基于PPIN的都勻毛尖根莖葉分析

王 芬， 張龍芬， 木 仁， 馬 媛， 郭治友， 崔寶祿， 李 靜， 張 雯

(1.黔南民族師范學院生物科學與農(nóng)學院， 貴州 都勻 558000；2.長順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 長順 550700)

茶產(chǎn)業(yè)是“一帶一路”國家戰(zhàn)略中的傳統(tǒng)優(yōu)勢特色外向型產(chǎn)業(yè)，發(fā)展前景廣闊。茶樹是世界上最受歡迎的非酒精飲料作物之一[1]，也是非常重要的商業(yè)化飲料作物[2]；茶樹是中國西南地區(qū)的特有種，目前種植在40多個國家[3-4]。貴州特有的喀斯特地貌氣候呈立體結(jié)構(gòu)，年均降水量1 500 mm，適宜的溫度孕育了豐富多樣的茶樹資源[5]，是茶樹的發(fā)源地及茶葉經(jīng)濟的故鄉(xiāng)[6]。截止2016年，貴州的茶葉種植面積達到4.4×105hm2，是茶葉種植面積最大的省份[7]，主要品種為福鼎大白茶，具有繁殖力強、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應性廣的特性。茶葉的流行不僅僅是因為特殊的風味，更是由于主要的次生代謝產(chǎn)物——茶多酚[9-10]。它對人體有益[11]，可以抗菌[12]，抗腫瘤，具有抗氧化活性[13-15]，對心血管疾病、肥胖、糖尿病和代謝綜合征都有療效[16-17]。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡[18]是指一個物種內(nèi)的所有蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，并從信號轉(zhuǎn)導、生化等角度進行研究。揭示蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖，已成為蛋白組學[19]研究的熱點，也是后基因組時代的難題所在。蛋白質(zhì)相互作用是生物體進行代謝活動的基礎(chǔ)，因此，在所有生命活動中，都有蛋白質(zhì)相互作用現(xiàn)象的發(fā)生。研究都勻毛尖的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可以對茶的整個生物過程有一個綜合的理解。

以貴州省黔南州喀斯特山區(qū)優(yōu)勢茶葉品種福鼎大白種茶為材料，利用二代Illumina測序平臺對其進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析根莖葉的差異基因，構(gòu)建差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。挖掘都勻地區(qū)福鼎大白種茶參與類黃酮生物合成、萜類化合物生物合成等代謝途徑的相關(guān)基因，揭示影響茶多酚代謝的關(guān)鍵因素，為培育更好的茶樹品種探尋茶多酚代謝機理提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料福鼎大白種茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze)，是2018年11月在黔南州都勻市紅敏茶園剪取的枝葉扦插所得，在培育的茶苗中選取培養(yǎng)條件相同、長勢情況基本一致、沒有被污染的茶苗植株9盆，分為3組，分別取嫩根、嫩莖和嫩葉標為“根1重復、根2重復、根3重復，莖1重復、莖2重復、莖3重復、葉1重復、葉2重復、葉3重復”，放入液氮中再放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 方 法

將二代Illumina測序得到的結(jié)果進行基因表達量分析，并進一步分析葉與莖、葉與根、莖與根的差異表達基因，運用同源比對的方法將差異基因與STRING 9.1數(shù)據(jù)庫進行比對以及提取出差異表達分析結(jié)果與STRING 9.1數(shù)據(jù)庫收錄的互作關(guān)系，再利用Cytoscape 3.3.0將比對上的差異基因進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建，分別構(gòu)建出葉與莖、葉與根、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡并對網(wǎng)絡進行合并。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用Illumina測序平臺對福鼎大白種進行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)基因表達量篩選根、莖、葉的差異基因，通過同源比對的方法以及差異表達分析結(jié)果和STRING 9.1數(shù)據(jù)庫收錄的互作關(guān)系對，構(gòu)建差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(表1)。

表1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用數(shù)目

2.2 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的拓撲屬性

將葉與莖、葉與根、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡合并為一個大的綜合差異基因互作網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡共4 249個節(jié)點，66 342個互作。從聚合系數(shù)、直徑、半徑、最短路徑、特征路徑長度等方面對4個網(wǎng)絡的特性進行比較，發(fā)現(xiàn)差異不顯著，并且網(wǎng)絡表現(xiàn)出小世界特性(表2)，大部分節(jié)點不與彼此鄰接，但是可以從任一其他點經(jīng)少數(shù)幾步就可到達。

表2 4個網(wǎng)絡的全局特性

中介中心性的值介于0與1之間，是指網(wǎng)絡中的節(jié)點充當其它兩個節(jié)點之間最短路徑的中介次數(shù)，次數(shù)越高，中介中心性就越大(圖3 a)。蛋白i的度是與此蛋白相連節(jié)點數(shù)，即蛋白i的互作數(shù)目，i的度越高，說明蛋白i越重要。在葉和莖、葉和根、莖和根以及合并的網(wǎng)絡中，發(fā)現(xiàn)節(jié)點的度符合冪律分布(圖3 b)，其中葉與根的差異基因蛋白互作網(wǎng)絡中，P(x)≈854.28x-1.174，R2=0.738，相關(guān)性是0.959。葉與莖的網(wǎng)絡中，P(x)≈509.82x-1.194，R2=0.747，相關(guān)性是0.955。莖與根的網(wǎng)絡中，P(x)≈543.96x-1.281，R2=0.759，相關(guān)性是0.863。在合并的網(wǎng)絡中，P(x)≈888.33x-1.15，R2=0.692，相關(guān)性是0.939。說明大多數(shù)蛋白的相互作用數(shù)較少，很少一部分蛋白質(zhì)的連接度較高，是一種無尺度現(xiàn)象。接近中心性的值也介于0和1之間，是指網(wǎng)絡中的一個節(jié)點與其它節(jié)點的接近程度，即一個節(jié)點到其它節(jié)點的平均最短路徑的倒數(shù)(圖3 c)。蛋白u的拓撲系數(shù)是Tu=avg(S(u,v))/nu。S(u,v)表示u和v共同的相鄰蛋白數(shù)，nu表示u的鄰居數(shù)(圖3 d)。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中功能模塊分析

在葉與莖、葉與根、莖與根以及合并的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中，利用Cytoscape 3.3.0的插件MCODE分別預測出66、99、62個和110個功能模塊(表3)，參數(shù)設置為默認，對于蛋白質(zhì)功能預測以及揭示各種生化反應過程的分子機理都有著極大的幫助。葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中最大的功能模塊(圖2)得分為56.941，具有120個節(jié)點，3 388個互作，主要參與植物病原互作通路，植物激素信號轉(zhuǎn)導通路等。

表3 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中的功能模塊特性

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中蛋白質(zhì)的功能與關(guān)鍵蛋白預測

利用差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可以預測蛋白質(zhì)的功能。在一個蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中，如果已知某些蛋白質(zhì)的功能，那么與之相連的其他蛋白可能具有類似的功能。葉與莖的差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡中共15 764個互作，其中TEA 003744，TEA 019056，TEA 020779，TEA 005686，TEA 008246，TEA 000931，TEA 024511，TEA 033307是相互作用數(shù)最多的8個蛋白(表4)，它們在功能上具有相似性。TEA003744是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有ATP結(jié)合功能，參與信號轉(zhuǎn)導，與其互作的蛋白有281個，由此可以推出這281個蛋白也可能具有類似的功能。

表4 葉與莖差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡關(guān)鍵蛋白

利用Cytoscape 3.3.0提取葉與莖差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中最大的一個子網(wǎng)(圖3)，具有1 062個節(jié)點，13 726個邊，紅色的節(jié)點代表度最大的8個節(jié)點，與整體網(wǎng)絡一致，通過子網(wǎng)也可以預測蛋白質(zhì)的功能。

3 討 論

利用STRING 9.1數(shù)據(jù)庫和同源比對方法預測出葉與莖有15 764個蛋白質(zhì)相互作用，葉與根有49 191個相互作用，莖與根11 406個互作，合并的網(wǎng)絡共有66 342個相互作用。4個網(wǎng)絡都符合冪律分布，即少部分蛋白具有高連接度，而大部分蛋白的連接度較低。葉與根的差異基因的蛋白質(zhì)相互作用最多，可能由于葉與根差異基因較多導致。對四個網(wǎng)絡的聚合系數(shù)、直徑、半徑、最短路徑、特征路徑長度等特性進行比較分析，差異不大，并且網(wǎng)絡表現(xiàn)出小世界特性。

利用Cytoscape 3.3.0的插件MCODE分別預測出4個網(wǎng)絡的功能模塊，對于蛋白質(zhì)功能預測意義重大。其中茶多酚相關(guān)功能模塊打分為9.412，具有18個節(jié)點和80個互作(圖3)。該18個蛋白主要是細胞色素P 450、香葉醇8-羥化酶、氧化酶、類吡喃二烯氧合物、類黃酮。全部參與茶多酚次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸和代謝，主要表現(xiàn)為油菜素類固醇生物合成、類黃酮生物合成、二萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成、甲基赤蘚糖4-磷酸途徑。分子功能主要體現(xiàn)在氧化還原酶、金屬離子結(jié)合、芳香化酶活性等。因此，推斷18個蛋白均與茶多酚功能相關(guān)，為培養(yǎng)茶樹新品種提供理論依據(jù)。

通過差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可以預測蛋白質(zhì)的功能。都勻毛尖福鼎大白茶富含茶多酚，具有提神醒腦、抑制動脈粥樣硬化、抑菌抗癌等功能。都勻毛尖特有的芳香主要自類黃酮和萜類化合物等的代謝，通過差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可以預測與類黃酮等物質(zhì)相關(guān)的基因。本研究結(jié)果可為類黃酮等物質(zhì)的代謝機理研究提供一定的理論依據(jù)，為培養(yǎng)良種茶樹提供理論參考。