矮牽牛梅林愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

張潔 鄭益平 楊成龍 林覓 林智敏

摘 要：為建立矮牽牛梅林的高頻再生體系，以葉器官為材料，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、葉片不同部位和不同形態(tài)愈傷對(duì)不定芽再生的影響。結(jié)果表明：6BA和NAA及其配比極顯著影響矮牽牛梅林不定芽再生率，其中NAA 0.3 mg·L-1 極顯著促進(jìn)了矮牽牛梅林不定芽的再生，6BA和NAA濃度超過(guò)1.0 mg·L-1和0.5 mg·L-1時(shí)，刺激玻璃化的發(fā)生。葉片不同部位極顯著影響不定芽的再生，芽分化率由高到低依次是葉柄>帶主葉脈>不帶主葉脈，愈傷組織形態(tài)決定芽分化能力和質(zhì)量，葉柄直接分化叢芽是梅林再生的優(yōu)良外植體，分化率達(dá)98.3%。芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，其產(chǎn)生不定芽無(wú)玻璃化且分化率高，為68.3%。葉片愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6BA 1. 0 mg· L-1+NAA 0. 3 mg·L-1，其不定芽分化率為68.3%且未產(chǎn)生玻璃化苗;最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，生根率達(dá)100.0%;繼代增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+6BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，叢生芽多且大小均勻。

關(guān)鍵詞：矮牽牛梅林;組織培養(yǎng);愈傷;植株再生

中圖分類號(hào)：S 682.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）05-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.05.005

Callus Induction and Plant Regeneration of Petunia Hybrida Meilin

ZHANG Jie， ZHENG Yi-ping， YANG Cheng-long， LIN Mi， LIN Zhi-min*

（Biotechnology Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstracts： In order to establish a high frequency regeneration system of Petunia hybrida Meilin， the effects of different ratios of growth regulators， different parts of leaves and different forms of callus on the regeneration of adventitious buds were studied. The results showed that 6BA， NAA and their ratios had significant effects on the regeneration rate of adventitious buds of Petunia hybrida. Among which，

0.3 mg·L-1 NAA significantly promoted the regeneration of adventitious buds of Meilin. When the concentration of 6BA and NAA respectively exceeded 1.0 mg·L-1 and 0.5

mg·L-1， the occurrence of vitrification was stimulated. Different parts of leaves significantly affected the regeneration of adventitious buds. The bud differentiation rate from high to low was petiole， with main vein， and without main vein. The ability and quality of bud differentiation were determined by the shape of callus. The direct differentiation of cluster buds from petioles was an excellent explant for the regeneration of Meilin， with the differentiation rate of 98.3%. The optimal medium for the induction of bud was MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1， the adventitious buds were produced without vitrification and the differentiation rate was high， reaching 68.3%. The optimal medium for the induction of leaf callus was MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1， and the differentiation rate of adventitious bud was 68.3% without vitrification. The best rooting medium was 1/2 MS medium， in which the rooting rate could reach 100.0%. The optimal medium for the multiplication culture was MS+6BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1， and the cluster buds were

abundant and uniform in size.

Key words： Petunia hybrida Meilin;Tissue culture;Callus;Plant regeneration

矮牽牛Petunia hybrida為茄科碧冬茄屬，一年或多年生草本花卉。1985年Horsch等[1]首次獲得矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株，此后基因工程技術(shù)在矮牽牛的應(yīng)用不斷展開[2-4]，矮牽牛也因其生活周期短，遺傳背景清晰且易于進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，逐漸成為花卉轉(zhuǎn)基因的模式植物[5]。植物再生系統(tǒng)的建立是進(jìn)行基因工程研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)矮牽牛植株再生的研究較為深入，但矮牽牛再生方式受基因型限制，不同學(xué)者得出的結(jié)論也不盡相同[6-9]。矮牽牛梅林作為早花抗病品種而在城市園林綠化中應(yīng)用廣泛，呂晉慧等[10]以10個(gè)矮牽牛品種為材料建立再生體系，發(fā)現(xiàn)梅林系列葉盤再生率極低，僅為41.33%和9.65%，同時(shí)在前期的觀察發(fā)現(xiàn)梅林再生過(guò)程中極易玻璃化，且后期無(wú)法改良。因此針對(duì)這些問(wèn)題，本試驗(yàn)以矮牽牛梅林為材料，研究其愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生體系的建立，為進(jìn)一步開展矮牽?；蚬こ萄芯孔龊脺?zhǔn)備工作，也為其他觀賞植物的基因功能鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

矮牽牛梅林由東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同激素組合對(duì)葉片愈傷誘導(dǎo)及芽分化的影響 以矮牽牛葉器官為外植體，切成0.8 cm×0.8 cm塊狀，近軸面朝上，接種在MS附加不同濃度6BA（0.5～2.0 mg·L-1）和NAA（0.1～0.5 mg·L-1）的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化。每個(gè)處理接種20塊，3次重復(fù)，觀察記錄愈傷和不定芽情況，并于35 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。

1.2.2 不同部位外植體對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響 以不同部位葉片為外植體，即切去葉緣分為不帶主葉脈（上部葉）、帶主葉脈（中下部葉）、葉柄3個(gè)部分，近軸面朝上，接種在

MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種20塊，3次重復(fù)，觀察記錄出芽率、出芽數(shù)（塊）和出芽時(shí)間。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)獲得的芽從其基部切下，接種在MS附加不同濃度6BA（0.5～1.0 mg· L-1 ）和NAA（0.01～0.3 mg·L-1 ）的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20塊，3次重復(fù)，觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將單芽接種于MS和1/2MS附加NAA 0～0.1 mg· L-1 和 6BA 0～0.2 mg· L-1的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10個(gè)芽體，3次重復(fù)，觀察生根率及其生長(zhǎng)情況。

培養(yǎng)條件：以Sigma的MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基，瓊脂 6 g· L-1，pH 5.8。溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度1500～2000 lx，光照時(shí)間為16 h·d-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行方差分析與多重比較（Duncan′s法）。

計(jì)算方法如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=愈傷塊數(shù)/總塊數(shù)×100;

不定芽分化率（%）=分化不定芽塊數(shù)/總塊數(shù)×100;

出芽數(shù)（塊）=總出芽數(shù)量/出芽塊數(shù);

生根率（%）=生根芽/總芽數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)葉片愈傷誘導(dǎo)及芽分化的影響

將矮牽牛葉片接種在MS附加6BA和NAA的培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)。接種7 d后，葉片開始膨大卷曲，傷口處開始出現(xiàn)愈傷組織，其生長(zhǎng)狀況見表1。由表1可知，矮牽牛葉片在培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)出愈傷組織，6BA濃度過(guò)高會(huì)使愈傷組織水漬化，濃度過(guò)低則無(wú)法形成具有分化能力的顆粒狀胚性愈傷;當(dāng)6BA濃度超過(guò)1.0 mg·L-1和NAA濃度超過(guò)0.5 mg·L-1時(shí)不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。同時(shí)，方差分析表明6BA和NAA及其配比極顯著影響矮牽牛不定芽再生率，其中NAA 0.3 mg·L-1 極顯著促進(jìn)了矮牽牛梅林不定芽的再生，當(dāng)葉片接種在MS+

6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基中，其產(chǎn)生不定芽無(wú)玻璃化現(xiàn)象且分化率高，為68.3%。葉片愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化情況見圖1。

2.2 不同部位外植體對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響

從激素篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不定芽常在主脈切口處大量發(fā)生，因此將葉片分為葉柄、帶主脈、不帶主脈置于MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行不同部位分別誘導(dǎo)，其生長(zhǎng)狀況見表2。不帶主葉脈的葉片先誘導(dǎo)出愈傷組織，之后少量分化成單芽;帶主脈葉片在主脈處形成愈傷組織或直接分化成芽;而葉柄在培養(yǎng)過(guò)程中則沒(méi)有明顯的愈傷組織形成，器官直接再生成叢芽（圖2）。不同外植體誘導(dǎo)的出芽率及出芽數(shù)差異達(dá)極顯著，由高到低依次是葉柄>帶主葉脈>不帶主葉脈，不帶主葉脈的葉片較難誘導(dǎo)出芽，出芽率僅為13.3%，而帶主脈葉片出芽率達(dá)76.7%;葉柄出芽率達(dá)98.3%，每塊出芽數(shù)可達(dá)6.9塊，且出芽最早，是適宜的遺傳轉(zhuǎn)化材料。

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)獲得的芽從其基部切下，接種于附加NAA和6BA的MS和1/2 MS培養(yǎng)基中，通過(guò)芽生芽途徑進(jìn)行增殖，接種后5～7 d，基部膨大長(zhǎng)出一些細(xì)小的叢生芽，15 d左右小芽長(zhǎng)大，變成一簇叢生芽。繼代增殖過(guò)程中6BA濃度超過(guò) 0.5 mg·L-1則容易形成愈傷而不分化叢芽;添加NAA則有利于壯苗，濃度為0.1 mg·L-1時(shí)叢生芽多且大小均勻;MS+6BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1利于芽的繼代增殖（表3）。同樣，把未分化出芽的愈傷切下，遵循激素濃度遞減原則進(jìn)行繼代培養(yǎng)，觀察愈傷組織發(fā)現(xiàn)，沙瓤狀愈傷分化率極低，或是分化出玻璃化苗（圖3a、3b），只有致密凸起的顆?；鷤M織才可獲得較高的增殖系數(shù)（圖3c、3d）。

2.4 生根培養(yǎng)

將生長(zhǎng)健壯（高度超過(guò)2 cm）的不定芽，接種在MS和1/2 MS附加NAA 0～0.1 mg·L-1和6BA 0～0.2 mg·L-1培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。從表4可以看出，MS和1/2 MS附加6BA均不利于根的誘導(dǎo)，無(wú)法產(chǎn)生根系，而附加NAA 0.1 mg·L-1對(duì)MS培養(yǎng)基條件下根的數(shù)量有促進(jìn)作用，對(duì)1/2 MS條件下根的數(shù)量無(wú)影響，且根較細(xì)長(zhǎng);不定芽在不添加激素的MS或1/2 MS的培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生根，但1/2 MS的效果比MS要好，根萌發(fā)早且粗長(zhǎng)，生根率達(dá)100.0%（圖4） 。

3 討論與結(jié)論

矮牽牛作為花卉遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，其植株再生體系的建立已被廣泛研究。然而受基因型的影響，不同品種再生能力差異很大。本研究結(jié)果表明，矮牽牛梅林葉盤出愈率高，但分化能力不強(qiáng)，這與呂晉慧等[10]研究一致。愈傷狀態(tài)決定了愈傷分化的能力，當(dāng)6BA濃度在0.5 mg·L-1時(shí)容易出現(xiàn)無(wú)效的沙瓤狀愈傷組織，當(dāng)6BA濃度在1.0 mg·L-1以上時(shí)，才能產(chǎn)生致密凸起的顆粒狀愈傷組織，且NAA對(duì)這種愈傷組織的形成有促進(jìn)作用，其中0.3 mg·L-1 NAA極顯著促進(jìn)了梅林不定芽的再生，當(dāng)葉片接種在MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基中，其不定芽分化率為68.3%。

值得注意的是，與其他品種不同，梅林在組織培養(yǎng)過(guò)程中極易出現(xiàn)玻璃化苗，當(dāng)6BA濃度高于1.0 mg·L-1或NAA濃度高于0.5 mg·L-1時(shí)均會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗，且后期無(wú)法改良。李柯[11]研究也發(fā)現(xiàn)矮牽牛朝陽(yáng)對(duì)6BA、NAA敏感，容易出現(xiàn)玻璃化，以添加6BA 0.5 mg·L-1最有利于朝陽(yáng)再生。而漫波紅色[12]、美聲、黃金[10]、重瓣矮牽牛[13]、MD（Mitchell Diploid）[14]等品種對(duì)6BA耐受能力較強(qiáng)，6BA 2～3 mg·L-1為最適濃度。不同品種矮牽牛玻璃化的易感度可能受基因型和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的雙重影響。

同一植物不同部位再生能力不同，矮牽牛莖尖、莖段、葉片及花蕾等作為外植體均可誘導(dǎo)出芽，其中葉片的再生能力較強(qiáng)[15-20]。本研究以梅林葉器官的不同部位為材料，發(fā)現(xiàn)其分化能力存在很大差異。葉柄以器官直接再生途徑分化為叢芽，出芽率達(dá)98.3%，12 d完成芽分化;不帶主葉脈的葉片先誘導(dǎo)出愈傷組織，之后少量分化成單芽，出芽率僅為13.3%;帶主脈葉片在主脈處形成愈傷組織或直接分化成芽，屬于中間形態(tài)。目前，矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化常通過(guò)葉盤法誘導(dǎo)葉塊產(chǎn)生愈傷組織進(jìn)而分化成芽的形式建立轉(zhuǎn)化體系[21-23]。曹尚杰等[24]以梅林葉盤為材料通過(guò)愈傷分化成芽的方式獲得7個(gè)陽(yáng)性植株。然而，經(jīng)歷脫分化-再分化的愈傷途徑再生完整植株，存在分化時(shí)間長(zhǎng)、容易發(fā)生遺傳突變等問(wèn)題[25-26]，直接誘導(dǎo)叢生芽的方式更適合作為遺傳轉(zhuǎn)化基因功能鑒定的方法[11]。本研究結(jié)果表明，矮牽牛梅林葉柄通過(guò)器官直接再生途徑獲得叢生芽時(shí)間短、分生力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單， 且產(chǎn)生變異率和嵌合體的概率相對(duì)較低，是理想的遺傳轉(zhuǎn)化材料。陶妹英等[27]研究也表明矮牽牛器官直接再生途徑比愈傷組織途徑獲得不定芽時(shí)間短，且不定芽生長(zhǎng)狀況好，根系生長(zhǎng)快。

綜上，以矮牽牛梅林葉器官為外植體建立再生體系，最佳的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16BA+0.3 mg·L-1 NAA，芽分化率由高到低依次是葉柄>帶主葉脈>不帶主葉脈，葉柄以器官直接再生途徑分化成叢生芽，其出芽早，出芽率達(dá)98.3%，是適宜的遺傳轉(zhuǎn)化材料;MS+6BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1 適合繼代增殖培養(yǎng);1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率達(dá)100.0%。因此，該品種適合作為轉(zhuǎn)基因材料，能夠?yàn)檫M(jìn)一步基因工程改良矮牽牛以及花卉植物基因功能鑒定提供良好的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）

收稿日期：2021-04-24

作者簡(jiǎn)介：張潔，女，1983年生，碩士，助理研究員，主要從事園藝植物研究。

通信作者：林智敏，男，1976年生，博士，副研究員，主要從事分子生物學(xué)研究（E-mail：lzmfaas@sina.com）。

基金項(xiàng)目：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自由探索科技創(chuàng)新項(xiàng)目（ZYTS2021006）。