基于PI3K/Akt通路研究理中湯治療胃潰瘍大鼠的作用機制*

陳永祥，王明娟，周舟

1.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）屬于常見的消化性潰瘍疾病，是發(fā)生在胃竇、胃角、賁門、裂孔疝等部位的炎性壞死性疾?。?］。物理及化學因素引起的胃黏膜氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)均為GU發(fā)病的主要原因［2］。GU病程較長且病情易反復，若不及時治療可能演變?yōu)槲复┛?，危及患者的生命安全?］。中醫(yī)學歸結(jié)“寒、熱、虛、實”等因素實施辨證論治，在GU的臨床治療中取得了一定的成效［4］。理中湯是《傷寒論》中的溫中名方，有溫中祛寒、補虛回陽之效。本研究旨在探討理中湯對大鼠醋酸性GU的保護作用。

1 材料

1.1 動物50只3月齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK2006009。飼養(yǎng)在22～25℃室溫，相對濕度45%～55%環(huán)境，自由進食飲水，自然光照，處理方法遵守動物倫理原則。

1.2 藥物與試劑理中湯（由附子、人參、干姜、白術(shù)、炙甘草組成，購自湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院）；雷尼替?。ū贝筢t(yī)藥股份有限公司，批號：200506）；PI3K、Akt、GAPDH抗體（美國CST公司，貨號分別為：6342S、4968S、3263S）；水合氯醛（上海澤葉生物科技有限公司，貨號：ZY-6604）；冰醋酸（上海高創(chuàng)化學科技有限公司，貨號：0714-2.5L）；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，貨號分別為：DS-535、DS-309、DS-320）；BCA定量檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司，批號：KGP856）；DMSO（美國Sigma公司，D5879）；Marker（Fermentas公司，貨號：26384）；ECL熒光底物（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：DW102-04）；Trizol試劑（Takara公司，批號：A4537）；RNA提取試劑盒（德國QIAGEN，貨號：）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司，貨號R6943）；RIPA裂解液（日本TaKaRa，貨號：RR3792）；引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 儀器DMLS2型顯微鏡（德國Leica公司）；TP1020型生物組織脫水機（德國Leica公司）；NP-B型生物組織包埋機（德國Leica公司）；RM2235型切片機（德國Leica公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

2 方法

2.1 動物分組與建模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用雙盲法對大鼠進行隨機分組，即正常對照組、模型組、理中湯低劑量組、理中湯高劑量組與雷尼替丁組，每組10只。采用乙酸注射法制備GU大鼠模型，具體方法［5-6］：術(shù)前大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg·kg-1）進行麻醉，然后將大鼠固定在動物手術(shù)臺上，剃除腹壁毛后進行常規(guī)消毒。沿劍突向下切開腹壁（約2 cm）將胃剝離，采用微量注射器于胃壁肌層處注入20μL乙酸，出現(xiàn)半透明白斑后將胃送回腹腔，切口用生理鹽水清洗，之后覆蓋網(wǎng)膜并將腹壁縫合，正常對照組注射同體積的生理鹽水。

2.2 給藥方法術(shù)后1 d給予各組大鼠藥物灌胃治療，成人理中湯臨床劑量約為1 g·kg-1，根據(jù)動物體表面積換算法大鼠的給藥劑量約6 g·kg-1，故本研究設(shè)置理中湯低劑量為6 g·kg-1，理中湯高劑量為12 g·kg-1，雷尼替丁劑量為0.3 g·kg-1，正常對照組與模型組給予同體積的生理鹽水灌胃，均連續(xù)給藥2周。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠血清炎性因子的檢測 末次給藥1 h后采用水合氯醛麻醉大鼠，取大鼠血清，ELISA法檢測大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.3.2 HE染色觀察大鼠胃組織病理變化情況 每組隨機3只大鼠，取其胃組織于固定液（Bouin＋福爾馬林）中，待蛋白質(zhì)變性后將固定液沖洗干凈；石蠟包埋切片，烘干切片后脫蠟經(jīng)梯度乙醇脫水；蘇木素染色10 min，沖洗后鹽酸乙醇分化，沖洗干凈后伊紅染色30 s，脫水透明封片后鏡檢，觀察大鼠胃組織病理變化。

2.3.3 RT-PCR法檢測大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平 每組隨機選擇3只大鼠，取胃組織樣本，通過Trizol法提取總RNA，采用核酸定量分析儀檢測RNA濃度，檢測吸光度，（260 nm處）/（280 nm處）均在1.8～2.0，反轉(zhuǎn)為cDNA擴增。內(nèi)參基因為β-actin，參考試劑盒說明書設(shè)置各項參數(shù)，95℃預變性2 min→95℃變性15 s→60℃退火60 s，循環(huán)40次，65℃終末延伸5 s。記錄擴增曲線，通過比較2-ΔΔCt值法計算相對表達量。具體的引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.4 Western Blot檢測大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達 每組隨機選擇3只大鼠，取胃組織，充分剪碎后加入裂解液（PMSF＋RIPA）制備成勻漿，冰浴后離心。取上清液通過BCA試劑盒進行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，按1∶1 000比例加入一抗兔抗多克隆PI3K、Akt抗體與二抗山羊抗兔IgG，轉(zhuǎn)膜、顯色、成像，采用Quantityone軟件掃描各條帶灰度，對蛋白表達量進行分析。

2.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清炎性因子的檢測與正常對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表2 對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 （±s，ng·L-1）

表2 對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 TNF-α IL-1βIL-6正常對照組10 - 2.58±0.11 3.45±0.16 2.70±0.13模型組 10 - 4.27±0.23* 4.78±0.20* 3.55±0.26*理中湯低劑量組 10 6 3.91±0.25 4.58±0.26 3.41±0.09理中湯高劑量組 10 12 3.16±0.18＃ 4.10±0.28＃ 3.10±0.27＃雷尼替丁組 10 0.3 3.48±0.10＃ 4.25±0.34＃ 3.22±0.28＃

3.2 大鼠胃組織病理變化正常對照組大鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)排列整齊，未出現(xiàn)充血、水腫等癥狀；模型組大鼠胃黏膜腺體消失，出現(xiàn)明顯的瘢痕組織與壞死層，充血、水腫癥狀較為嚴重；理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組可見壞死層減少，胃黏膜腺體水增加，充血、水腫癥狀明顯減輕。見圖1。

圖1 大鼠胃組織病理變化（HE，×100）

3.3 RT-PCR法檢測大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平與正常對照組比較，模型組大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組均可降低大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平（P＜0.05）。見表3。

表3 對大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平的影響 （±s）

表3 對大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 PI3K mRNA AktmRNA正常對照組3- 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 3 - 1.38±0.04*1.35±0.04*理中湯低劑量組 3 6 1.28±0.02 1.26±0.03理中湯高劑量組 3 12 1.21±0.03＃1.12±0.01＃雷尼替丁組 3 0.3 1.25±0.05＃1.21±0.02＃

3.4 Western Blot檢測大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達與正常對照組比較，模型組大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組均可明顯下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 對大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達的影響

圖2 大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達

4 討論

GU是一種常見多發(fā)病，幽門螺桿菌感染、藥物及飲食因素、應(yīng)激精神因素、遺傳因素等均可誘發(fā)GU［7］。具有易感傾向人群受到不良因素刺激時，巨噬細胞與淋巴細胞被激活并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子［8-9］。TNF-α參與調(diào)節(jié)免疫細胞活化炎癥反應(yīng)，其水平異常上調(diào)可改變血管通透性并誘導產(chǎn)生凝血酶，促使胃黏膜微血管在炎癥發(fā)生時形成微血栓引起黏膜微循環(huán)障礙，同時還會進一步促進IL-6等炎性細胞因子的釋放，加重胃損傷［10-11］。IL-6可調(diào)節(jié)T細胞活化［12］，大量炎癥細胞聚集可導致粒細胞呼吸爆發(fā)并產(chǎn)生大量活性氧加重炎癥反應(yīng)［13］，活化的中性粒細胞又可分泌TNF-α等炎性細胞因子，擴大炎癥反應(yīng)［14］。GU病理過程中，IL-1β可以趨化炎性細胞在病灶部位聚集并促使白細胞黏附分子表達，其自身水平也會明顯上調(diào)，可作為判斷GU嚴重程度的指標［15］。研究發(fā)現(xiàn)，理中湯可下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達，降低胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平說明PI3K/Akt信號通路參與了大鼠GU病理變化過程［16］。PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞代謝、分化、增殖、凋亡的重要通路［17］，其中PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與v.sre和v.ras等癌基因產(chǎn)物相關(guān)，本身具有磷脂酰肌醇激酶與絲氨酸/蘇氨酸激酶活性［18］。Akt是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，參與細胞增殖、細胞遷移、細胞凋亡等過程［19］。PI3K由催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成，其被激活時，p110可誘導PIP2轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3與Akt結(jié)合促使其活化［20］。PI3K、Akt基因及蛋白異常表達會促進細胞發(fā)生凋亡并推動GU疾病進展。

中醫(yī)學并無GU的病名記載，但根據(jù)其節(jié)律性、周期性上腹疼痛的特點，可將其歸于“胃脘痛”“胃痛”等范疇［21］。胃脘痛的病機在于脾胃虛弱、肝胃失和、外邪犯胃，脾胃虛寒是GU的常見類型［22］。隨著人們生活品質(zhì)的提高與飲食結(jié)構(gòu)的變化，長期的飲食不節(jié)與身心壓力均會引起脾胃虛寒，久而成疾［23］。《傷寒論》中記載理中湯具有補氣健脾、補虛回陽的功效，方中人參補脾益肺、大補元氣，用于治療脾虛食少、體虛欲脫之癥；干姜回陽通脈、溫中逐寒，可發(fā)諸經(jīng)之寒氣，治感寒腹痛［24］。藥理學研究，白術(shù)、甘草具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗消化道潰瘍的作用［25-26］。諸藥配伍可補益脾腎、中陽建運，下降濁陰、上升清陽，標本兼治，療效顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，附子理中湯可以有效改善GU模型大鼠消瘦、飲食下降等癥狀，并保護胃黏膜細胞，減輕其水腫、炎性細胞浸潤等，對胃組織起到保護作用［27］。有研究認為，PI3K、Akt基因及蛋白表達水平異常會促進炎性細胞因子釋放并誘導胃黏膜細胞發(fā)生凋亡，從而加重GU病情［28］。陳小娟等［29］指出，加速胃黏膜潰瘍修復需要下調(diào)炎性因子表達水平，調(diào)節(jié)TLR-2/MyD88信號通路。夏菁等［30］指出，吳茱萸堿可以通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路，減輕炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷從而起到保護胃黏膜的作用。

GU的發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)，且通過干預某些信號通路能夠降低炎性細胞因子表達水平，從而起到改善GU的效果。治療GU的關(guān)鍵在于通過調(diào)節(jié)信號通路抑制炎癥反應(yīng)等對胃組織的不良刺激，從而改善GU病情。

綜上所述，理中湯可明顯降低胃潰瘍大鼠血清炎癥水平，下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達，可能與調(diào)控PI3k/Akt通路有關(guān)。但誘發(fā)GU的機制多樣，涉及的信號通路也較為復雜，理中湯抗乙酸所致GU的具體作用過程還需進一步進行研究。