基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制

金芬，周英惠，張吉，郭偉堃

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530001

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜腔被覆黏膜及宮體肌層以外的雌激素依賴性疾?。?］。育齡期是子宮內(nèi)膜異位癥的高發(fā)年齡，子宮內(nèi)膜異位癥的患病率為9.5%，25%～40%不孕患者與此病有關(guān)，20%～90%慢性盆腔疼痛及痛經(jīng)患者存在子宮內(nèi)膜異位癥［2-3］。子宮內(nèi)膜異位發(fā)病機制至今尚未明確，治療方法有局限性。該病的發(fā)生率呈明顯上升趨勢，患者經(jīng)常出現(xiàn)如月經(jīng)間期出血、痛經(jīng)、性交疼痛、大便困難和尿痛等［4］。因此，積極防治子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，減輕和控制疼痛，治療和促進生育對育齡期婦女的身心健康具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認為，子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜有周期性地出血，屬“離經(jīng)之血”，其病位在下焦，女子胞?！堆Y論》“既然是離經(jīng)之血，雖清血、鮮血，亦是瘀血”。因此，子宮內(nèi)膜異位癥最基本的病理基礎(chǔ)為血瘀。桂枝茯苓丸出自《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治》，具有活血化瘀、緩消癥塊之功效。研究表明，桂枝茯苓丸能抑制異位內(nèi)膜血管生長［5-6］，使異位內(nèi)膜萎縮、壞死［7］，緩解疼痛［8-9］，提高妊娠成功率［10］，對子宮內(nèi)膜異位癥的治療具有明顯療效［11-13］。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制，闡明桂枝茯苓丸中藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理，為臨床使用桂枝茯苓丸提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 桂枝茯苓丸的分子化合物及靶點通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索桂枝茯苓丸所包含的5味中藥，即桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍中各味中藥的分子化合物，篩選符合生物利用度（oral availability，OB）大于30%，類藥性（drug-likeness，DL）大于0.18的候選藥物分子化合物，獲取候選分子化合物對應(yīng)的作用靶點，整理后導(dǎo)入Excel表格。

1.2 子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)靶點通過OMIM（https：//omim.org/）數(shù) 據(jù) 庫 及GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫以“endometriosis”作為關(guān)鍵詞檢索子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點，將得到的靶點信息保存在Excel表格，合并后去除重復(fù)，得到子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點。

1.3 中藥-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)用R軟件將中藥靶點及疾病靶點的靶點名稱轉(zhuǎn)換為對應(yīng)ID，去除重復(fù)的靶點，得到中藥預(yù)測靶點數(shù)據(jù)集與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集，進行映射，兩者取交集后所得的重復(fù)靶點視為桂枝茯苓丸作用于子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)測靶點，并繪制venny圖。運用STRING軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interation，PPI），應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建桂枝茯苓丸與子宮內(nèi)膜異位癥的中藥-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，然后進行拓撲分析獲得自由度大于2的核心蛋白，并選取前30個核心蛋白繪制柱狀圖。

1.4 GO及KEGG富集分析使用GO數(shù)據(jù)庫及KEGG數(shù)據(jù)庫對方藥的關(guān)鍵靶點進行基因功能及靶點通路分析，以“P＜0.05，基因數(shù)≥10”作為節(jié)點，得到桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥可能性較大的基因功能及作用機制通路。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸篩選出的分子化合物以O(shè)B大于30%，DL大于0.18作為篩選條件，經(jīng)篩選得到桂枝7個化合物，茯苓15個化合物、牡丹皮11個化合物、桃仁23個化合物、赤芍30個化合物，刪除重復(fù)化合物，共得到76個候選化合物。

2.2 桂枝茯苓丸中分子化合物相關(guān)的靶基因桂枝茯苓丸共有238個驗證靶點及272個預(yù)測靶點，使用R軟件將靶點名稱轉(zhuǎn)換為對應(yīng)ID，去除重復(fù)ID的靶點后，得到184個藥物靶點，共獲得1 403個子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點。

2.3 構(gòu)建中藥-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)得到桂枝茯苓丸有效成分及靶點、子宮內(nèi)膜異位癥各靶點的關(guān)系即藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖1），篩選出桂枝茯苓丸作用于子宮內(nèi)膜異位癥的有效成分有endometriosis、（-）-taxifolin、guizhifulinwan、betasitosterol、sitosterol、（＋）-catechin、ent-epicatechin、taxifolin、mairin、kaempferol等共38種，這些化合物作用于PTGS1、PTGS2、PGR、NCOA2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PON1、MAP2等135個疾病靶點。映射構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2），得出99個有效靶點，共1 747條相互作用關(guān)系，平均自由度為35.3，聚合系數(shù)為0.9。節(jié)點的自由度表示在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點直接相互作用的節(jié)點數(shù)目，節(jié)點的自由度越大，則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強。經(jīng)過對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，選取自由度為前30的蛋白作為核心蛋白，得到AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3、EGF、MAPK1、EGFR等30個Hub蛋白（表1）。

圖2 桂枝茯苓丸靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表1 Hub蛋白

圖1 桂枝茯苓丸-靶點-子宮內(nèi)膜異位癥網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶基因相關(guān)的功能及通路富集分析通過GO分析探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥預(yù)測靶點的功能分布，富集通路共120條。其中預(yù)測靶點的分子生物功能有：染色質(zhì)結(jié)合（chromatin binding）、蛋白質(zhì)異二聚體化活（protein heterodimerization activity）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、輔助因子結(jié)合（cofactor binding）和近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合（proximal promoter sequencespecific DNA binding）等靠在前列。通過KEGG通路探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥預(yù)測靶點的通路分布，富集結(jié)果包括：人類巨細胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒（kaposi sarcoma-associated herpesvirus）、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAG信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、流體剪切應(yīng)力和動脈硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙型肝炎（hepatitis C）、P13K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）、白細胞介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等共150條。

功能富集（圖3）及通路富集（圖4）結(jié)果排在前20條通路以氣泡圖直觀表示，節(jié)點的顏色與大小由相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量和P值決定，顏色從藍色到紅色反應(yīng)P值從大到小，節(jié)點從小到大反映了相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量從少到多。

圖3 CO分析氣泡圖

圖4 KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

桂枝茯苓丸為復(fù)方中藥，具有多成分、多靶點、多系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特點。由Hopkins［14］提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，可以構(gòu)建中藥復(fù)方-中藥-有效成分-藥物靶標網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測中藥中多靶點相互作用效果以及中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索篩選出藥物及疾病相關(guān)靶點，并對靶點進行通路富集分析，預(yù)測桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效成分、靶點及相關(guān)信號通路。

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍5味中藥組成。方中桂枝溫通血脈，牡丹皮、芍藥涼血散瘀，桃仁破血消癥，茯苓滲濕祛痰，運用此方治療子宮內(nèi)膜異位癥，具有活血化瘀、緩消癥塊的功效。本研究篩選出桂枝丸的有效成分及靶點后，與子宮內(nèi)膜異位癥的疾病靶點取交集，并通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)得出有效靶點，并篩選出AKT1、IL-6、VEGFA等30個核心蛋白，參與多種生物調(diào)節(jié)過程，主要包括物質(zhì)代謝、細胞增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)化和程序性細胞死亡、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)。通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶點的分子生物功能120條及所在的生物通路150條，發(fā)現(xiàn)其治療子宮內(nèi)膜異位癥可能主要通過抑制炎癥反應(yīng)、抗血管生成、抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、抗腫瘤等機制。在上述信號通路中，AGE/RAGE信號通路主要與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的主要受體稱為糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE或AGER），屬于免疫球蛋白超家族，被稱為模式識別受體。AGE/RAGE信號通路可激活多種細胞內(nèi)信號通路，包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs，進而導(dǎo)致-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化。NF-κB是一種幾乎存在于所有細胞類型的多效性轉(zhuǎn)錄因子，是一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的終末點，可促進促炎性細胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α［15］和多種動脈粥樣硬化相關(guān)基因的表達，包括VCAM-1、VEGF和RAGE。此外，通過RAGE誘導(dǎo)JAK-STAT介導(dǎo)的通路和PI3K-Akt依賴通路，分別參與細胞增殖和凋亡。其治療子宮內(nèi)膜異位癥可能通過抑制NF-κB、IL-6、IL-8及CCL2等趨化因子，從而抑制炎癥反應(yīng)。已有相關(guān)臨床及實驗研究證實，桂枝茯苓丸可通過抑制炎性因子分泌阻斷單核巨噬細胞活化及炎性浸潤，減輕異位子宮內(nèi)膜細胞的黏附、增殖及纖維合成［16-19］，進而延緩疾病的進展。

本研究中多個信號通路如Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis等均涉及VEGF表達，VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，在血管生成和內(nèi)皮細胞生長中起作用，其誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制細胞凋亡、誘導(dǎo)血管通透化。桂枝茯苓丸可能通過降低VEGF表達［20-21］、抑制血管生成［22］、阻礙子宮內(nèi)膜異位病灶區(qū)生長，達到延緩子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，這與林立鵬等［23-24］的研究一致。從桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)通路，如Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、Colorectal cancer等通路中，桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥還可能通過細胞周期阻滯、抑制細胞分化、抗腫瘤等機制。通過調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路中JUN、p21、原癌基因（Myc）、細胞周期蛋白D1（cycD1）等分子活性，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖［25-26］、分化和凋亡，抑制子宮內(nèi)膜組織的生長［27］。

綜上所述，本研究從分子水平上探討了桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥主要活性成分和潛在的分子作用機制，為后續(xù)該藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制提升及作用機制的研究提供理論依據(jù)。