氟比洛芬酯介導(dǎo)MAPK信號通路保護腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障功能的機制研究

程晶晶，程少飛，遲曉慧

(邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000)

缺血性腦血管疾病在臨床上具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高等特點[1]。腦缺血在一定時間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng)后，如不采取積極的進一步治療，會出現(xiàn)更嚴重的神經(jīng)功能障礙，即為腦缺血再灌注損傷[2]。尋找療效明確的治療缺血性腦血管疾病的藥物以及機制探討一直是臨床研究的熱點。氟比洛芬酯是一種非甾體類靶向鎮(zhèn)痛消炎藥，國外研究[3]發(fā)現(xiàn)，氟比洛芬酯有一定的抗腦缺血再灌注損傷、保護血腦屏障的作用，但作用機制尚未明確。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)部的重要傳遞者，MAPK信號通路在基因表達調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，MAPK信號通路為參與血腦屏障保護作用的重要通路，p38 MAPK是MAPKs的亞類之一，是此通路的關(guān)鍵蛋白。本研究旨在探討氟比洛芬酯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障功能的影響，分析氟比洛芬酯介導(dǎo)磷酸化p38 MAPK信號通路保護血腦屏障功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠72只，體重280～320 g，由邯鄲市中心醫(yī)院實驗動物中心提供，并獲實驗倫理委員會審批通過。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注損傷組(IR組)和氟比洛芬酯組(F組)，每組各24只大鼠。氟比洛芬酯注射液購于北京泰德制藥股份有限公司；磷酸化p38 MAPK單克隆抗體試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司；伊文思藍(EB)溶液由美國Sigma公司生產(chǎn)；澳美耐OMNI Sonic Ruptor 4000超聲波細胞破碎儀由美國OMNI公司生產(chǎn)；DR6000 紫外-可見光分光光度計由美國HACH公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注大鼠模型制作 F組和IR組大鼠采用改良Koizumi線栓法建立腦缺血再灌注經(jīng)典模型[7]，具體步驟為：腹腔注射10%水合氯醛100 mg進行麻醉，起效后，切開大鼠頸正中皮膚，暴露頸部血管，4-0尼龍線頭端制作成鼓槌狀。分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈，并從分叉處插入尼龍線至頸內(nèi)動脈，深度約17 mm，并保持有一定阻力，以阻斷大腦中動脈起始端所有的側(cè)支循環(huán)血流造成腦缺血。2 h后，將尼龍線抽出，恢復(fù)大腦中動脈血供，即再灌注。Sham組只實施麻醉、切開大鼠頸正中皮膚、分離血管但不結(jié)扎大腦中動脈。

1.2.2 給藥方法 再灌注即刻給藥，F(xiàn)組大鼠腹腔注射氟比洛芬酯10 mg/kg，Sham組和IR組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.3 指標(biāo)檢測 (1)大鼠腦組織含水量檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，斷頭并低溫摘取大鼠腦組織，分離左右大腦半球，先稱濕重，然后置于烤箱烘干水分后稱干重。腦組織含水量百分比=(濕重-干重)/濕重×100%。(2)大鼠血腦屏障通透性檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，股靜脈注入2%伊文思藍(EB)溶液2 mL/kg染色。1 h后，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后打開胸腔，經(jīng)心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區(qū)的腦組織，吸去殘余水分，然后每100 mg腦組織加入甲酰胺溶液1 mL，60 ℃水浴24 h，1 000 rpm離心5 min，用DR6000 紫外-可見光分光光度計在620 nm波長處測吸光度。作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腦組織EB含量。肉眼觀察各組大鼠腦組織EB染色形態(tài)學(xué)大體外觀，并于熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦組織EB紅斑分布。(3)p38 MAPK蛋白表達檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，采用免疫組化技術(shù)檢測p38 MAPK蛋白表達。具體方法為：①組織切片制作。麻醉后打開胸腔，經(jīng)心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區(qū)的腦組織，經(jīng)過脫水、固定、包埋等步驟制作石蠟切片。取500 mL的抗原修復(fù)工作液浸泡組織切片，120 ℃加熱煮沸20 min，冷卻至室溫，取出組織切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min、自來水沖洗3 min。組織切片晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。②SP法進行免疫組化染色。加入p38 MAPK一抗(p38 MAPK的羊抗鼠單克隆抗體工作液)40 μL，另外選取磷酸鹽緩沖液作為一抗的陰性對照，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液50 μL，染色時間大約5～10 min，顯微鏡下觀察。③評分標(biāo)準(zhǔn)。由病理中心兩名醫(yī)師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分兩部分評分[8]。顯色深淺度評分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性細胞數(shù)評分：0分為陽性細胞數(shù)<5%，1分為陽性細胞數(shù)5%～25%，2分為陽性細胞數(shù)26%～50%，3分為陽性細胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細胞數(shù)≥76%。累計得分0～1分為(﹣)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。(4)p38 MAPK蛋白相對表達量檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，采用免疫印跡(Western blot)檢測p38 MAPK蛋白相對表達量。具體方法為：麻醉后打開胸腔，經(jīng)心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區(qū)的腦組織，每100 mg組織加入蛋白裂解液1 mL，刀片式組織破碎勻漿器1 000～3 000 rpm高速勻漿3次，離心取上清液，調(diào)整所有蛋白樣本至等濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維束薄膜上，封閉，加入p38 MAPK一抗，室溫下孵育1 h，洗滌；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，洗滌。采用HRP-ECL發(fā)光法曝光，取出膠片浸入顯影液至完全顯影，清水沖凈晾干。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照計算p38 MAPK蛋白的相對表達量。免疫印跡重復(fù)試驗至少3次。蛋白含量根據(jù)western blot結(jié)果條帶的灰度值計算，使用Image J軟件，導(dǎo)入western blot條帶圖片，把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片，設(shè)置定量參數(shù)把Western blot條帶圖片轉(zhuǎn)換成亮帶，選定亮帶，點擊菜單欄Analyze下拉出現(xiàn)的measurement，彈出選定區(qū)域的灰度統(tǒng)計值，重復(fù)上述步驟直至所有條帶都被測量。在Excel表格錄入數(shù)據(jù)，將目的蛋白的灰度值除以GAPDH內(nèi)參蛋白的灰度值，得到p38 MAPK蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織含水量比較

F組的腦組織含水量高于Sham組，但低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組腦組織EB含量比較

F組的腦組織EB含量高于Sham組，但低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2-圖4。

2.3 各組腦組織切片免疫組化法的p38 MAPK蛋白表達比較

F組的腦組織切片p38 MAPK蛋白陽性表達的等級高于Sham組，但低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖5。

表1 各組腦組織免疫組化法的p38 MAPK蛋白表達比較[n(%)]

2.4 各組腦組織免疫印跡法的p38 MAPK蛋白相對表達量比較

F組的腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量高于Sham組，但低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的病理機制較為復(fù)雜，目前主流學(xué)說提出可能與自由基及脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥免疫反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、高能磷酸化合物缺乏等有關(guān)[9-10]。血腦屏障是維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，可阻止有害物質(zhì)由血液進入大腦，其功能受損是腦缺血再灌注損傷的重要表現(xiàn)之一，易引起腦水腫，神經(jīng)元死亡，加重腦損害。本研究采用大鼠腦缺血再灌注經(jīng)典模型，缺血2 h，再灌注24 h后測大鼠腦組織含水量及EB含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，IR組的腦組織含水量明顯增高，提示大鼠腦缺血再灌注后發(fā)生腦水腫；IR組的EB含量也明顯增高，提示大鼠血腦屏障受到破壞，血腦屏障通透性增加，結(jié)果與Guo等[11]研究報道相符，說明建模成功。

近年研究[12]發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK與血腦屏障功能密切相關(guān)。在腦缺血病理情況下，腦組織p38 MAPK表達明顯增加。本研究采用免疫組化法及免疫印跡法檢測p38 MAPK表達量，發(fā)現(xiàn)IR組的腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量高于Sham組，提示大鼠腦缺血再灌注后p38 MAPK表達上調(diào)，與Jiang等[13]研究報道相符。p38 MAPK是MAPK家族成員之一，參與應(yīng)激壓力與炎癥細胞因子的激活，p38介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)與細胞凋亡，因此目前多將p38作為抗炎藥物的靶位[14-15]。p38 MAPK信號通路也由三級激酶鏈組成，表現(xiàn)為逐級磷酸化，包括MKK3、MKK4及MKK6，是p38的特異性蛋白激酶[16]。

本研究進一步探討了氟比洛芬酯對保護血腦屏障功能的影響及介導(dǎo)MAPK信號通路的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組腦組織含水量、腦組織EB含量均低于IR組，提示氟比洛芬酯能降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫。此外，F(xiàn)組腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量低于IR組，提示氟比洛芬酯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷、保護血腦屏障功能的機制可能與抑制MAPK信號通路、下調(diào)p38 MAPK表達有關(guān)。侯莉莉等[17]對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型實施氟比洛芬酯后處理，同樣發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)腦組織的p38 MAPK表達下調(diào)，并認為氟比洛芬酯降低血腦屏障通透性的機制可能與其抑制p38 MAPK信號通路激活有關(guān)。Wu等[18]采取氟比洛芬酯預(yù)先給藥，腦組織含水量和EB含量均降低，且炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)水平降低，同樣提示其機制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，且MAPK信號通路在其中有重要作用。還有研究[19]發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注經(jīng)氟比洛芬酯處理后，環(huán)氧酶-2(COX-2)及p38 MAPK蛋白表達下調(diào)，并認為其機制可能是氟比洛芬酯抑制了p38MAPK信號通路，下調(diào)了COX-2表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。腦缺血再灌注后，在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)下一些炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1等激活p38 MAPK信號通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞、基底膜、星形膠質(zhì)細胞的細胞膜的脂溶性改變，血腦屏障通透性增加，引起腦水腫和神經(jīng)元損傷。氟比洛芬酯是一種非甾體類消炎藥，通過抑制p38 MAPK信號通路，并進一步抑制COX-2，阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，減少炎癥細胞因子生成，減輕了腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激，進而保護神經(jīng)功能。

綜上所述，氟比洛芬酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，保護血腦屏障功能，機制可能與抑制MAPK信號通路、下調(diào)p38 MAPK表達有關(guān)，可為氟比洛芬酯血腦屏障保護作用的機制研究提供參考。