白背葉楤木愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化

張新軍，吳瞾賢，吳銀梅★，楊順強，王世敏

（1 昭通學(xué)院，云南昭通 657000；2 鹽津縣第二中學(xué)，云南昭通 657000）

白背葉楤木（Aralia chinensis L.var.nuda Nakai）為五加科（Araliaceae）楤木屬木本植物楤木（Aralia chinensis L.）的原變種，又稱刺龍牙、刺嫩芽、刺苞、刺老苞等。本變種和原變種（楤木）的區(qū)別在于小葉片下面為灰白色，除側(cè)脈上有短柔毛外余無毛，圓錐花序的主軸和分枝疏生短柔毛或幾無毛，苞片呈長圓形，長6～7mm[1]。白背葉楤木在我國分布范圍廣泛，云南省主要分布于滇西北至滇中一帶，在昭通市魯?shù)榭h、大關(guān)縣、鎮(zhèn)雄縣、彝良縣、威信縣比較常見，常野生于海拔1500～3000m 的濕潤山坡林緣及水溪邊。每年3—5 月，楤木頂芽萌發(fā)，頂芽外層包有5～7 片肉質(zhì)化膜片，形成紫紅色的鮮嫩芽苞，即為刺老苞，是珍貴的野生木本蔬菜。

同時，白背葉楤木具有藥食兼用的效果?！兜崮媳静荨酚涗洠簶B木能治風(fēng)濕病、胃病，舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛，樹皮及根均有健脾養(yǎng)胃、促進排尿等作用。近幾年研究表明：刺老苞含有豐富的藥物活性成分，包括皂苷、萜類、黃酮、生物堿、鞣質(zhì)，具有多種預(yù)防和治療疾病的療效[2]。作為蔬菜食用，新鮮的刺老苞可煮或炒，也可作干菜處理后食用，味道甘苦可口，營養(yǎng)物質(zhì)豐富。李美娟等[3]測定了其營養(yǎng)成分，結(jié)果表明：其含有14 種氨基酸、10 種人體所需的常量元素和微量元素，是典型的高鉀低鈉保健蔬菜[4]，深受消費者喜愛，目前市場上供不應(yīng)求[5]、經(jīng)濟價值高。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對于楤木屬其它植物的研究主要集中在藥理、營養(yǎng)價值等方面[6～9]，僅見該屬另一種植物遼東楤木的組織培養(yǎng)研究報道[10]，而白背葉楤木相關(guān)研究未見報道。因此，可用正交試驗優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)條件，為該資源的開發(fā)利用和種苗擴繁奠定基礎(chǔ)。

1 材料

試驗材料為野生白背葉楤木的嫩莖和嫩葉（采自云南省昭通市昭陽區(qū)騾馬河水庫旁林地）。

2 試驗方法

2.1 消毒處理

選取健康完整、無損壞的嫩莖和嫩葉，用自來水沖洗2～4h 后，用細毛刷輕輕刷掉表面的泥塵雜物，再在超凈工作臺用75%酒精浸泡15s，用無菌水沖洗3 次。再用0.1%HgCl2處理3min，不斷晃蕩，用無菌水沖洗5次，將其放在培養(yǎng)皿中的濾紙上，用解剖刀將葉片切成1cm2的大小，將嫩莖切成長1cm 的莖段放入培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)備接種到MS 培養(yǎng)基中。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將處理好的外植體材料接種到添加有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種5 瓶，每瓶接種4 個。所有接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，放入人工培養(yǎng)箱中進行愈傷組織的發(fā)生，接種10d 后觀察其啟動情況，每隔5d 觀察1 次，統(tǒng)計愈傷出現(xiàn)時間、愈傷數(shù)量、愈傷組織的顏色和形態(tài)及增長的高峰期。

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)箱溫度控制在（25±1）℃，光照強度為1500～2000Lx，濕度為60%，培養(yǎng)基pH 值為5.8～6.0。

2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS 23.0 軟件處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同外植體出愈結(jié)果

在相同激素配比的MS 培養(yǎng)基中，嫩莖和嫩葉產(chǎn)生愈傷組織的時間不同，嫩莖在培養(yǎng)12d 后開始出現(xiàn)愈傷組織。嫩葉在培養(yǎng)15d 以后葉面內(nèi)卷，開始出現(xiàn)愈傷組織，且質(zhì)地較硬、色澤較莖的愈傷組織暗淡，容易出現(xiàn)褐化。嫩莖產(chǎn)生的愈傷組織大部分質(zhì)地疏松柔軟、組織面積大、色澤光亮，呈現(xiàn)黃綠色；嫩莖的愈傷組織誘導(dǎo)率最高達到100%，最低也有70%；嫩葉的愈傷組織誘導(dǎo)率最高為85%，最低只有20%。綜上可知，白背葉楤木愈傷組織誘導(dǎo)最佳外植體為嫩莖。

3.2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3.2.1 不同激素配比對嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響。接種12d 后A2培養(yǎng)基中的外植體最早出現(xiàn)愈傷組織，其次是A1、A3、A4培養(yǎng)基出現(xiàn)愈傷組織。A1、A2、A3愈傷組織塊較大，A4、A5、A7、A8培養(yǎng)基出現(xiàn)愈傷組織且較小，A4、A6、A9愈傷不明顯。培養(yǎng)25d，愈傷組織的生長效果達到最佳，誘導(dǎo)情況（見表1），30d 以后，愈傷組織開始衰老和壞死。

表1 不同濃度激素配比對嫩莖愈傷誘導(dǎo)結(jié)果

首先，A1和A3愈傷組織生長狀態(tài)相近，外表光滑、色澤明亮，呈現(xiàn)黃綠色，愈傷組織體積最大，生長效果最好，誘導(dǎo)率達100%，與其他組有明顯差異。其次，以A2、A4和A6培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織最好，光澤明亮，呈黃綠色，3 個配方又以A2的愈傷效果最佳，誘導(dǎo)率達到100%。A7、A9的誘導(dǎo)效果最差，愈傷組織覆蓋面積小，顏色為黃白色，上面出現(xiàn)大量白色顆粒狀愈傷組織，表面干燥。

極差R 值越大，表示該因素影響也越大。由此可知，3 種激素對白背葉楤木嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)影響為：6-BA＞2，4-D＞NAA。當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為0.5mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，2，4-D 其次，并以1.0mg/L最佳，NAA 作用相對較小，以0.1 mg/L最好。因此，白背葉楤木無菌嫩莖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2，4-D0.1mg/L。

3.2.2 不同激素配比對嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將無菌嫩葉接種到不同濃度激素組合的MS 培養(yǎng)基中，25d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)情況（見表2）。

表2 不同濃度激素組合對嫩葉愈傷誘導(dǎo)的作用

接種10d 后，葉片開始卷曲，葉片增大；15d 后，葉脈、葉片切割處開始出現(xiàn)白色顆粒狀愈傷組織。接種25d 時，愈傷組織快速生長，并出現(xiàn)褐化，30d 后褐化嚴(yán)重，并且開始死亡。

由表2 可知，A5和A2培養(yǎng)方案的愈傷組織出愈率最高，可達到85%、80%，愈傷組織大塊，呈現(xiàn)黃綠色，在后期出現(xiàn)褐化；A9的出愈率最低，只有20%，愈傷效果最差，只在葉脈和葉柄處有小顆粒黃綠色愈傷組織，生長緩慢且愈傷啟動時間也較晚。

通過分析，極差R 的值越大，表示該因素的影響越大。由此可知，對白背葉楤木嫩莖誘導(dǎo)愈傷組織的影響為：NAA＞6-BA＞2，4-D。萘乙酸的濃度增大，愈傷組織誘導(dǎo)率先增大后減小，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為1.0mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，6-BA 對白背葉楤木組織愈傷誘導(dǎo)率的影響比NAA 較小，以1.0mg/L誘導(dǎo)效果最佳，2，4-D 影響最小，以0.2mg/L誘導(dǎo)效果最佳。因此，以無菌嫩葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D0.1mg/L。

4 結(jié)論與討論

本研究中，外植體嫩莖的愈傷組織誘導(dǎo)率高于嫩葉，且嫩莖出現(xiàn)愈傷組織的時間較早。接種第12d 出現(xiàn)愈傷組織，生長快速，愈傷組織呈現(xiàn)淺黃綠色，質(zhì)地疏松。嫩葉出現(xiàn)愈傷組織時間比嫩莖晚，接種第15d 出現(xiàn)愈傷組織，愈傷組織生長緩慢，呈黃綠色、質(zhì)地緊密。這一結(jié)果與趙恒田等[11]研究遼東楤木最佳外植體幼葉結(jié)果不同，這也說明同屬不同種植物、不同外植體愈傷效果有差異；嫩葉愈傷的生長情況與孔凡芹等研究楤木胚狀體的誘導(dǎo)結(jié)果相似[12]，且葉脈最先出現(xiàn)愈傷組織，這可能與葉脈作為物質(zhì)運輸和交換組織，最先受到激素刺激從而作出相應(yīng)的反應(yīng)有關(guān)[13-14]。

在本研究中，嫩莖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L；嫩葉的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L。對比其它楤木屬植物的研究，張云[15]關(guān)于棘莖楤木愈傷組織誘導(dǎo)和趙恒田等[11]關(guān)于遼東楤木愈傷組織誘導(dǎo)中，同樣也用到6-BA、NAA、2，4-D 3 種激素，且誘導(dǎo)效果較好，說明6-BA、NAA、2，4-D 3 種激素對楤木屬植物愈傷組織誘導(dǎo)具有極大的促進作用。除此之外，在云南楤木和龍牙楤木愈傷組織誘導(dǎo)中也均用到6-BA[16-17]。由此可知，6-BA 對楤木屬植物愈傷組織誘導(dǎo)影響較大，這與6-BA 本身能促進細胞分裂，促進非分化組織分化的功能有關(guān)[18]。