肉豆蔻飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)性成分差異分析

★ 楊曉東 何廣銘 彭嬌 曾薈 潘曉君 譚梓君 陶晨璐 黃小丹（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室 廣東 佛山 528244）

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁。具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效；用于脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛、食少嘔吐［1］。肉豆蔻含有豐富的揮發(fā)油、脂肪油、苯丙素、木質(zhì)素等多種化學(xué)成分。揮發(fā)油是其主要的藥效部位，具有較強的抑菌、抗氧化作用［2-3］。

中藥揮發(fā)性成分在臨床療效中發(fā)揮著重要的作用。目前，含揮發(fā)性成分中藥配方顆粒生產(chǎn)中一般先提取其中揮發(fā)油成分，β-環(huán)糊精包合干燥后，加入噴干粉中混勻后干法制粒，但揮發(fā)油的加入量尚未明確規(guī)定，不同企業(yè)之間揮發(fā)油加入量差別較大，有文獻［4-5］報道中藥飲片與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油在化學(xué)成分與相對百分含量差異很大，因此本文對肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油進行研究，測量飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)性成分的含量，并用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對其化學(xué)成分進行分析，比較兩者之間的差異，可為肉豆蔻配方顆粒生產(chǎn)工藝改進提供一定的參考價值。

1 儀器與材料

安捷倫8890/7000D型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；移液槍（德國普蘭德公司）；JJ600型電子天平（常德市雙杰測試儀器廠）；陶瓷保健壺（3L，深圳一枚王有限公司）；揮發(fā)油提取裝置。

本實驗共收集15批肉豆蔻飲片，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定，均為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁，編號為S1～S15；肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑（實驗室自制）；乙醚（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取及測定飲片揮發(fā)油提?。喝∪舛罐嬈址奂s20 g，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加水500 mL與沸石數(shù)粒，按《中國藥典》2015年版揮發(fā)油測定法（通則2204）測定。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油提?。喊础吨兴幣浞筋w粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》(征求意見稿)規(guī)定，取100 g飲片，搗碎，加水煎煮兩次，第一次加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火保持微沸20 min，趁熱過濾后迅速冷卻。第二次加6倍量水，武火煮沸后文火保持微沸15 min，趁熱過濾后濾液冷卻，合并兩次濾液，制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑。將標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移置2 000 mL圓底燒瓶中，加沸石數(shù)粒，按《中國藥典》2015年版揮發(fā)油測定法（通則2204）測定。

2.2 工藝穩(wěn)定性驗證取同一批肉豆蔻飲片樣品（S1），按2.1項下肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法平行制備3份標(biāo)準(zhǔn)湯劑試樣并測定其中揮發(fā)油含量，計算轉(zhuǎn)移率。3次試驗中標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油平均含量為0.439 %，RSD為7.29 %；平均轉(zhuǎn)移率為6.27 %，RSD為7.29 %。以上指標(biāo)結(jié)果表明該工藝具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 揮發(fā)油測定結(jié)果取15批飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品分別按照“2.1”項下方法提取并測定揮發(fā)油，計算飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量與轉(zhuǎn)移率［揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率（%）=標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量（%，以飲片計）/飲片揮發(fā)油含量（%）×100］，結(jié)果見表1。

表1 工藝穩(wěn)定性驗證

由表2可知，15批肉豆蔻飲片揮發(fā)油含量均大于6.0 %，符合《中國藥典》2015版肉豆蔻揮發(fā)油項下“本品揮發(fā)油不得少于6.0 %”規(guī)定。15批肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量在0.324 %～0.670 %范圍內(nèi)，其轉(zhuǎn)移率為5.06 %～10.00 %。上述結(jié)果顯示，飲片中揮發(fā)油在煎煮過程中能部分轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)湯劑中，可為肉豆蔻配方顆粒生產(chǎn)中其揮發(fā)油的加入量提供參考。

表2 肉豆蔻飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油測定

2.4 飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油GC-MS對比分析

2.4.1 供試品溶液制備精密量取揮發(fā)油50 μL，置10 mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4.2 氣相色譜條件色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（柱長為30 m，內(nèi)徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm），程序升溫：初始溫度40 ℃，以每分鐘13 ℃的速率升溫至53 ℃，保持2 min，以每分鐘2 ℃的速率升溫至54 ℃，以每分鐘1 ℃的速率升溫至57 ℃，保持2 min，以每分鐘1 ℃的速率升溫至60 ℃，以每分鐘5℃的速率升溫至220 ℃；進樣量為1 μL；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣（99.999 %）；載氣流速為1.0 mL/min；不分流；溶劑延時3 min。

2.4.3 質(zhì)譜條件離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；進樣口溫度為250 ℃；質(zhì)荷比范圍35～550 m/z，掃描方式為全掃描。

2.4.4 測定方法及結(jié)果分別取15批肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制備樣品，按“2.2.2”項下氣相色譜條件與“2.2.3”項下質(zhì)譜條件進行測定，按峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。并通過NIST譜庫對化學(xué)成分進行檢索鑒定，肉豆蔻飲片及肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑均鑒定出32個化合物。結(jié)果見圖1-2和表3。

圖1 肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油總離子流圖

表3 肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油化學(xué)成分鑒定結(jié)果

由表3可知，從肉豆蔻飲片揮發(fā)油中共鑒定出32個揮發(fā)性成分,其主要成分為肉豆蔻醚（16.22 %）、 α-蒎烯（13.09 %）、偽檸檬烯（6.5 %）、（-）-4-萜品醇（5.61 %）、γ-松油烯（4.81 %）、黃樟素（4.69 %）、甲基丁香酚（3.77 %）、松油烯（3.58 %）、欖香素（3.45 %）。上述9種化合物的含量占飲片揮發(fā)油總量的61.72 %。肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中同樣鑒定出32個揮發(fā)性成分，其主要成分為肉豆蔻醚（22.8 %）、α-蒎烯（7.35 %）、偽檸檬烯（4.2 %）、（-）-4-萜品醇（4.86 %）、γ-松油烯（3.87 %）、黃樟素（3.91 %）、甲基丁香酚（5.26 %）、松油烯（2.91 %）、欖香素（6.30 %）。上述9種化合物的含量占標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油總量的61.46 %。

圖2 肉豆蔻飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油化學(xué)成分組成

3 分析與討論

3.1 揮發(fā)油測定結(jié)果分析《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）提出中藥配方顆粒研究應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為對照，藥效物質(zhì)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑保持基本一致且標(biāo)準(zhǔn)湯劑中有效成分含量的轉(zhuǎn)移率可接受的范圍為均值加減3倍SD。通過對15批肉豆蔻飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量進行測定發(fā)現(xiàn)，15批肉豆蔻飲片揮發(fā)油含量范圍為6.3 %～9.7 %，15批肉豆蔻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量范圍為0.324 %～0.688 %，揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率范圍為5.06 %～10.00 %，平均轉(zhuǎn)移率為7.23 %，SD為1.5 %，X±2SD為4.38 %～10.04 %。15批肉豆蔻揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率均在X±2SD范圍內(nèi)。本研究確定了肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量及轉(zhuǎn)移率范圍，可為肉豆蔻配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

3.2 實驗研究中分別對分流比、升溫速率進行優(yōu)化當(dāng)采用分流比（10∶1）、（20∶1）時，飲片揮發(fā)油離子流圖部分峰面積過小，響應(yīng)較低。當(dāng)提高升溫速率時，部分色譜峰重疊，分離效果較差。最終采用“2.4.2”項下氣相色譜條件進行樣品測定，所得總離子流圖分離效果好且色譜峰響應(yīng)適中。

3.3 氣相質(zhì)譜結(jié)果分析肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中共鑒定出32個共有成分，肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中含量最高的均為肉豆蔻醚，其含量分別為16.22 %，22.8 %。肉豆蔻醚具有一定的毒性，服用過量對胃腸道有抑制作用，甚至可致中毒，產(chǎn)生昏迷及驚厥［6］。因此，應(yīng)研究控制肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中肉豆蔻醚的含量提高肉豆蔻配方顆粒臨床應(yīng)用的安全性。肉豆蔻的主治功能為溫中行氣、澀腸止瀉［1］。揮發(fā)油中的α-蒎烯、甲基丁香酚是澀腸止瀉的主要活性成分。α-蒎烯具有較強的祛痰、抑菌、消炎與止咳作用［7］，其在飲片揮發(fā)油中的相對含量為13.09 %，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中的相對含量為7.35 %。飲片揮發(fā)油中α-蒎烯的相對含量略高于標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中的相對含量，可能原因為肉豆蔻在煎煮過程中，部分成分揮發(fā)所致。甲基丁香酚在抑菌、止瀉、清除氧自由基方面有重要作用［8-9］，飲片中甲基丁香酚的相對含量為3.77 %，標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中的相對含量為5.26 %，相對含量差異不明顯。

本文對肉豆蔻飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油進行定量與定性研究，發(fā)現(xiàn)兩者的組成成分與相對含量基本相同，該研究結(jié)果為肉豆蔻配方顆粒制備過程中有效保留揮發(fā)性成分提供參考。