白頭翁皂苷D白蛋白納米粒制備及初步質(zhì)量評價

★ 王凱艷 饒小勇, 楊婧 周冠芮 羅曉健, 張堯（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌 330006）

白頭翁皂苷D是從藥材白頭翁（Pulsatilla cheninsis(Bge.)Regel）中分離得到的一種具有抗腫瘤作用的化學(xué)成分，對肺癌、黑色素瘤及乳腺癌等表現(xiàn)較強(qiáng)的作用［1-2］。白頭翁皂苷D［3-4］是一種皂苷類化學(xué)成分，表現(xiàn)出皂苷類成分溶血通性，此外，前期研究結(jié)果表明其在水中溶解度較小，從而限制了發(fā)展成新藥，因此，亟需通過制劑手段改善溶解性、降低溶血性，提高其成藥性。

白蛋白因具有生物相容性好、生物可降解、生物利用度高等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種較好的載藥材料［5］。隨著紫杉醇白蛋白納米粒（商品名: Abraxane)在臨床上成功應(yīng)用，白蛋白納米制劑已成為藥物制劑的研究熱點(diǎn)，解決了眾多天然活性成分存在的溶解性差、生物利用度低等問題［6-7］，提高了該類成分的成藥性，為臨床用藥擴(kuò)大提供了可能，此外，白蛋白納米制劑由于緩釋作用可以改善化學(xué)成分的溶血性［8］。因此，本文在白頭翁皂苷D與白蛋白表現(xiàn)較強(qiáng)的結(jié)合作用前提下［9］，以牛血清白蛋白為載體材料，將白頭翁皂苷D研制成白蛋白納米粒，為其成藥性提供一種新的有效策略。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260 Series高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器、色譜工作站），MSA6.6S-CE型1/100萬電子分析天平（SARTORIUS），AB204-S型1/10萬電子分析天平( METTLER TOLEDO)，RO10多點(diǎn)磁力攪拌器（德國IKA儀器設(shè)備有限公司），BT100-2J蠕動泵驅(qū)動器（蘭格恒流泵有限公司），ZEN3690納米激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司），HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），Milli-Q純水處理系統(tǒng)（美國MILLIPORE公司），Tecnai Spirit 120kV 透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

1.2 試藥白頭翁皂苷D原料藥（江西本草天工科技有限責(zé)任公司，批號20171011，純度＞90 %），白頭翁皂苷D對照品（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心對照品室提供，純度＞99 %），牛血清白蛋白（上海羅氏制藥有限公司，純度≥98%），甲醇為色譜純Fisher Scientific（NJ，USA），其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 白頭翁皂苷D白蛋白納米粒的制備稱取牛血清白蛋白200 mg，溶于5 mL純化水中，作為水相。稱取白頭翁皂苷D原料15 mg，溶于4 mL有機(jī)溶劑中，作為有機(jī)相。取水相置磁力攪拌器上，設(shè)置攪拌速度為500 r·min-1，另取有機(jī)相以1 mL·min-1速度滴加至水相中，溶液形成乳白色膠狀混懸液。在相同攪拌的條件下，滴加2.5 %戊二醛200 μL，交聯(lián)固化12 h，即得白頭翁皂苷D白蛋白納米粒 混懸液。

2.2 白蛋白納米粒白頭翁皂苷D含量的測定

2.2.1 色譜條件采用煊美賽鉑思SHARPSIL-U C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇－水－甲酸（75∶25∶0.1），檢測波長為203 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 供試品的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備取白頭翁皂苷D約6 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，即得濃度為0.601 mg·mL-1對照品溶液，備用。

2.2.2.2 空白白蛋白納米粒待測樣品的制備稱取牛血清白蛋白200 mg置燒杯中，用5 mL純化水溶解，置磁力攪拌器上，設(shè)置攪拌速度為500 r·min-1。另取無水乙醇4 mL，以1 mL·min-1的速率滴加至白蛋白溶液，在繼續(xù)攪拌的條件下，滴加180 μL的2.5 %戊二醛溶液，攪拌固化12 h，即得空白白蛋白納米粒溶液。取空白白蛋白納米粒2.0 mL，置超高速離心管中，離心1 h（4℃，12 000 r·min-1），取上清液即為空白白蛋白納米粒待測溶液。

2.2.2.3 載藥白蛋白納米粒上清液樣品的制備取白頭翁皂苷D白蛋白納米粒2.0 mL，置超高速離心管中，離心1 h（4 ℃，12 000 r·min-1），即為載藥白蛋白納米粒上清液待測溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)取對照品溶液、空白白蛋白納米粒待測溶液及載藥白蛋白納米粒上清液待測溶液，分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖1-3。由圖可知，白蛋白對載藥待測溶液含量測定無干擾。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 空白白蛋白納米粒待測溶液色譜圖

圖3 載藥白蛋白納米粒待測溶液色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察取對照品溶液儲備液，加甲醇分別稀釋至濃度為0.060 1、0.120 2、0.300 5、0.601、0.901 5 mg·mL-1。取稀釋后的各對照品溶液和對照品儲備液，進(jìn)樣，記錄峰面積。以濃度為X、峰面積為Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 3 243.4X+12.212，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。由相關(guān)系數(shù)可知白頭翁皂苷D在濃度0.060 1-1.202 mg·mL-1之間呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)取對照品溶液，按確定色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算RSD為0.36 %，由結(jié)果說明測定方法儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一份白蛋白納米?；鞈乙海∑渲?.0 mL，共6份，置超高速離心管中，離心1 h（4 ℃，12 000 r·min-1），按確定的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算RSD為2.07 %，由結(jié)果說明溶液處理重現(xiàn)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取載藥白蛋白納米粒待測溶液1份，分別于0、1、2、3、6、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計算RSD為0.81 %，由結(jié)果表明待測上清液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的載藥白蛋白納米粒待測上清溶液共9份，按其含量的80、100、120 %加入白頭翁皂苷對照品溶液，混合均勻，依照確定液相條件測定混合液的含量，按公式：加樣回收率=（測定總量-加入量）/已知量×100 %計算，方法的回收率在96.42-101.25 %范圍內(nèi)，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 納米粒表征指標(biāo)的測定

2.3.1 納米粒粒徑及多分散系數(shù)（PDI）的測定方法采用激光粒度測定儀測定白蛋白納米粒的平均粒徑大小、分布范圍及多分散性。取適量白蛋白納米粒均勻分散在純化水中，置于樣品皿中，進(jìn)行測定。每份樣品測定重復(fù)3次。

2.3.2 納米粒包封率和載藥量的測定采用超高速離心法測定白頭翁皂苷D白蛋白納米粒的包封率和載藥量。取白頭翁皂苷D白蛋白納米?；鞈乙?.0 mL，置超高速離心管中，離心1h（4 ℃，12 000 r·min-1），取上清液，按照“2.2”項(xiàng)下含量測定方法測定，計算出白頭翁皂苷D白蛋白納米粒中游離的白頭翁皂苷D量，依據(jù)如下公式分別計算出納米粒載藥量和包封率，取其平均值。

2.4 納米粒制備影響因素的考察

2.4.1 有機(jī)相溶劑的考察有文獻(xiàn)［10］報道溶劑的極性對蛋白質(zhì)的乳化特性和界面構(gòu)象會產(chǎn)生一定的影響。因此，考察不同有機(jī)溶劑（70 %甲醇、70 %乙醇、甲醇∶二氯甲烷、乙醇∶二氯甲烷）對納米粒的影響。結(jié)果見表1。

由表1可知，不同的有機(jī)溶劑對白蛋白納米粒的粒徑和多分散系數(shù)均有一定影響。納米粒要求粒徑越小越好，多分散系數(shù)越小越好，綜合粒徑大小和多分散系數(shù)考慮，當(dāng)乙醇∶二氯甲烷=5∶1為有機(jī)相溶劑時可以獲得納米粒目標(biāo)粒徑。

表1 有機(jī)溶劑對納米粒特性的影響

2.4.2 有機(jī)相用量的考察考察有機(jī)相用量1.5、2.0、2.5、3.0 mL的乙醇∶二氯甲烷（5∶1）對白蛋白納米粒的影響，結(jié)果見表2。

表2 有機(jī)相用量對納米粒特性的影響

由表2可知，有機(jī)相用量對包封率、載藥量、和PDI影響不大，但對粒徑大小有影響，所考察有機(jī)相溶劑用量均能滿足目標(biāo)粒徑要求，考慮有機(jī)溶劑中二氯甲烷存在安全性問題，初步選擇有機(jī)相用量1.5 mL。

2.4.3 交聯(lián)劑用量的考察有文獻(xiàn)報道［11］交聯(lián)劑戊二醛對蛋白微觀形態(tài)與性能均會產(chǎn)生一定的影響?？疾旖宦?lián)劑戊二醛對白蛋白納米粒的影響，結(jié)果見表3。

表3 交聯(lián)劑用量對納米粒特性的影響

由表2-5可知，交聯(lián)劑用量對白蛋白納米粒的包封率和載藥量以及粒徑的影響均較小，說明戊二醛在154-280 μL范圍之內(nèi)均可獲得所需目標(biāo)產(chǎn)品。

2.4.4 交聯(lián)時間的考察考察不同交聯(lián)時間3、6、9和12 h對白蛋白納米粒的影響，結(jié)果見表4。

表4 交聯(lián)時間對納米粒特性的影響

由表4可知，隨著交聯(lián)時間的延長，對納米粒的包封率和載藥量幾乎沒有影響。但對粒徑大小和PDI有影響，當(dāng)交聯(lián)時間達(dá)到9 h后其平均粒徑與PDI均沒有變化，說明交聯(lián)時間9 h后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

2.5 制備方法的優(yōu)化根據(jù)單因素影響考察結(jié)果，選擇白蛋白的濃度、投藥量、有機(jī)相用量作為制劑的重要因素。采用Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，考察白蛋白用量（A）、有機(jī)相用量（B）、白頭翁皂苷D用量（C）對納米粒性質(zhì)的影響，以包封率（Y1，EE/%）、粒徑（Y2，Size/d.nm）和多分散性指數(shù)（Y3，PDI）為評價指標(biāo)，以粒徑（Y2）和多分散性指數(shù)（Y3）兩個指標(biāo)按標(biāo)準(zhǔn)化的0～1之間的“歸一值”，各指標(biāo)“歸一值”求算術(shù)平均數(shù)，得總評“歸一值”（overall desirability，OD）為評價指標(biāo)，計算為OD=（d1×d2×d3……dk）1/k進(jìn)行計算（k為指標(biāo)數(shù)）［12］。對于粒徑（Y2）和多分散性指數(shù)（Y3）兩個指標(biāo)值越小越好，選用di=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計及效應(yīng)面優(yōu)化白頭翁皂苷D白蛋白納米粒制備方法。因素水平見表5，試驗(yàn)安排和結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken 設(shè)計因素水平

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計表及結(jié)果值

2.5.1 方差分析和顯著性的檢驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件處理表6中所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以包封率、粒徑和多分散性指數(shù)為指標(biāo)分別對各影響因素進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，得Y1=87.05-3.31A-0.51B+7.90C（R2=0.492 7，P=0.027 6），Y2=221.78+136.51A+ 22.95B-312.01C-11.50AB-259.38AC-48.45BC-31.98A2+32.05B2-306.17C2（R2=0.917 2，P=0.004 8），Y3=0.29+0.047A-0.041B-0.18C-0.026AB-0.020AC+0.046BC+ 2.525E-003A2-0.038B2+0.16C2（R2=0.951 7，P=0.000 8），由擬合結(jié)果可知，包封率盡管P值有顯著性，但其相關(guān)系數(shù)R2擬合度不高，所以沒有做響應(yīng)值預(yù)測。粒徑和多分散性指數(shù)均體現(xiàn)出顯著性和良好的相關(guān)性，所以采用兩者的OD值為因變量，以白蛋白用量（A）、有機(jī)相用量（B）、白頭翁皂苷D用量（C）為自變量，進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合，得多元二次回歸方程OD=0.90-0.10A+0.044B+0.34C+0.033AB+0.12AC-0.050BC+0.020A2+0.019B2-0.32C2（R2=0.960 1，P=0.000 4），由R2和P值可知二項(xiàng)式模型具有較好的統(tǒng)計學(xué)意義，可信度較高可用作分析預(yù)測模型。并采用Design-Expert 8.0.6軟件對OD值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

表7 OD回歸方程的方差分析

由表7可知，各自變量對OD影響排序?yàn)镃＞A＞B；交互項(xiàng)AB和BC對OD均影響不顯著，AC對OD的影響顯著；二次項(xiàng)A2和B2對OD的影響不顯著，C2對OD的影響顯著。

2.5.2 效應(yīng)面分析為了更加了解各個自變量之間的影響及其對因變量的影響。依據(jù)回歸方程繪制了三維效應(yīng)面圖，見圖4。

圖4 各因素交互作用的效應(yīng)面圖

由圖4可知，白頭翁皂苷D的用量對OD值影響最大，其次為白蛋白用量，最小為有機(jī)相用量；在一定范圍內(nèi)，隨著白頭翁皂苷D用量減小，OD值急劇減小，表現(xiàn)曲面較陡；在一定范圍內(nèi)，隨著白蛋白用量和有機(jī)相用量減小，OD值有減小趨勢，表現(xiàn)曲面平緩。

2.5.3 最優(yōu)處方的預(yù)測與驗(yàn)證利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得最佳處方為白蛋白用量為100 mg，有機(jī)相用量1 mL，白頭翁皂苷D用量為22.78 mg。按最優(yōu)處方平行制備3批白蛋白納米粒，分別測定其粒徑和包封率，結(jié)果見表8。

表8 最佳實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證

由表8可知，實(shí)測值和模型預(yù)測值都比較接近，表明模型的預(yù)測性良好。

2.6 納米粒的質(zhì)量初步表征

2.6.1 形貌的表征取少量納米?；鞈乙?，加入注射用水稀釋，取稀釋液滴加到碳作為支持膜的銅網(wǎng)上，滴樣時要防止銅網(wǎng)翻轉(zhuǎn)，靜置數(shù)分鐘，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體。用2 %磷鎢酸溶液（1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)至pH=7.0）進(jìn)行染色，染色2 min用濾紙吸去染色液，自然晾干。在透射電鏡下觀察白頭翁皂苷D白蛋白納米粒的微觀結(jié)構(gòu)，并拍攝電鏡照片如圖5（B）。由透射電鏡圖可知，納米粒呈類球形，大小較均一，粒子之間沒有黏連的現(xiàn)象，分散性良好。

圖5 白頭翁皂苷D白蛋白納米粒形貌圖（A實(shí)物，B透射電鏡圖）

2.6.2 粒徑大小及分布的測定采用納米激光粒度儀測定白蛋白納米粒的粒徑大小、分布范圍及多分散性。結(jié)果見6。由圖可知，白頭翁皂苷D白蛋白粒徑主要分布比較集中，且粒徑大小為200 nm左右。

圖6 白頭翁皂苷D白蛋白納米粒的粒徑分布

2.6.3 載藥量和包封率的測定按確定的工藝和處方制備3批次白頭翁皂苷D白蛋白納米粒，測定產(chǎn)品的載藥量和包封率。結(jié)果見表9。

表9 納米粒的載藥量和包封率的測定

由表9可知，所制備的3批納米粒的載藥量和包封率接近，不存在明顯差異，表明確定的制備工藝穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

白蛋白納米粒常用的制備方法有去溶劑化法、乳化固化法、高壓均質(zhì)法等［13］，本文采用了常用的去溶劑化法，研究表明該方法可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。在制備預(yù)試過程中發(fā)現(xiàn)溶解白蛋白的水選擇很重要，采用自來水和生理鹽水溶解白蛋白后采用去溶劑制備納米粒時，混懸液易凝聚成團(tuán)，粒徑過大，現(xiàn)象與F.Galisteo-Gonzáleza［14］研究相類似，可能是自來水與生理鹽水中pH值和離子等的影響，所以最終確定采用純化水為水相溶劑。

制備過程中藥物加入方式通過蠕動泵加入，以恒定速度有效防止加入速度對納米粒的影響，并對輸藥管道采用藥液先飽和輸送管道的吸附性，以提高加藥量的準(zhǔn)確性。通過預(yù)試驗(yàn)和單因素考察，確定了制備過程關(guān)鍵影響因素為白蛋白用量、有機(jī)相用量以及投藥量，采用了Box-Behnken效應(yīng)面法評價了各因素對包封率、粒徑大小及分布的影響，繪制了各因素變化的效應(yīng)曲面圖，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得了最佳制備方式，建立了預(yù)測性良好的數(shù)學(xué)模型，該方法較常用的正交試驗(yàn)優(yōu)化法更直接、準(zhǔn)確度更好。

本文建立了穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的白蛋白納米粒中白頭翁皂苷D的含量測定方法，為制劑載藥量和包封率的測定奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通過對白頭翁皂苷D白蛋白納米制劑成型較為系統(tǒng)的研究，獲得穩(wěn)定、載藥量高的納粒制劑，雖然為白頭翁皂苷D臨床應(yīng)用提供了新策略，但該制劑在體內(nèi)安全性和體內(nèi)變化情況還有待于深入研究。