不同脂肪酸對體外培養(yǎng)的瘤胃微生物活力和蛋白質(zhì)含量的影響

皮 宇 經(jīng)語佳 王夢芝 王洪榮 王 慧 黃 蔚

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

油脂是反芻動物高溫或高產(chǎn)時(shí)期良好的能量補(bǔ)充物，但其中脂肪酸的不飽和鍵對瘤胃微生物具有一定的負(fù)效應(yīng)，這種負(fù)效應(yīng)有區(qū)系特異性(如不飽和脂肪酸對細(xì)菌有負(fù)效應(yīng)，飽和或不飽和脂肪酸對原蟲均有負(fù)效應(yīng))，可影響微生物的活力和其正常的發(fā)酵活動［1-4］。如果能充分利用微生物對脂肪酸響應(yīng)的差異性，那么添加適量脂肪酸可穩(wěn)定瘤胃發(fā)酵，提高微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量，提高能量和氮素的利用效率，為宿主提供能量與微生物蛋白質(zhì)［5-6］，對宿主的營養(yǎng)代謝、機(jī)體健康、生產(chǎn)性能等都至關(guān)重要。有研究表明隨著添加植物油脂中的不飽和脂肪酸的不飽和度的增加，體外瘤胃發(fā)酵的甲烷生成量顯著降低［7］。本實(shí)驗(yàn)室前期對微生物微循環(huán)的研究發(fā)現(xiàn)，適量比例和結(jié)構(gòu)的油脂能夠抑制原蟲吞噬細(xì)菌的微生物再循環(huán)，增加細(xì)菌生物量［8］。但目前對于脂肪酸影響瘤胃微生物的系統(tǒng)研究尚不多見。為此，本研究選用6種不同脂肪酸，探討其對體外培養(yǎng)的瘤胃微生物活力和蛋白質(zhì)含量的影響，以期為脂肪酸的體內(nèi)研究及油脂影響瘤胃微生態(tài)的機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取3頭1.5周歲、體重為(29.4±2.7)kg、裝有永久性瘤胃瘺管的山羊，分單舍飼養(yǎng)，以玉米+豆粕+羊草為常規(guī)飼糧，每日按體重的2.5%干物質(zhì)量供料，07:00和19:00等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與培養(yǎng)底物

試驗(yàn)設(shè)6個(gè)分別添加3%的硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸的試驗(yàn)組和1個(gè)添加3%棕櫚酸鈣的對照組，每組3個(gè)重復(fù)。另外設(shè)1個(gè)無底物的空白對照組。培養(yǎng)底物組成見表1。

1.3 體外培養(yǎng)與樣品采集

體外培養(yǎng)參照Menke等［9］的方法。培養(yǎng)試驗(yàn)開始前3 h內(nèi)配制好人工唾液，并利用自制的真空負(fù)壓裝置，在早飼前通過瘤胃瘺管分別從3只羊的瘤胃中采集500 mL瘤胃液，混合后經(jīng)4層紗布過濾，裝入保溫瓶，通CO2，置于39℃水浴中保溫待用。將配制好的培養(yǎng)液(人工唾液∶瘤胃液=2∶1)通入 CO2，39 ℃水浴預(yù)熱。

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)確稱取1.95 g培養(yǎng)底物置于不同標(biāo)號的三角瓶中，紫外滅菌30 min，再分別加入200 mL培養(yǎng)液，塞緊橡皮塞。通過進(jìn)氣管道通入CO2，39℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)開始后 0、3、6、9、12、18、24 h 即時(shí)測定 pH，并取樣10 mL即刻分裝于離心管中，保存于-20℃冰箱，用于氨氮濃度、總脫氫酶及轉(zhuǎn)氨酶活性和微生物蛋白質(zhì)含量的測定。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 pH的測定

采用上海雷磁試驗(yàn)設(shè)備廠pHS-3C型pH計(jì)，測定前用pH=4.01和pH=6.88的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正。

1.4.2 氨氮濃度和微生物蛋白質(zhì)含量的測定

氨氮濃度參照馮宗慈等［10］的方法進(jìn)行測定。參照Wang等［11］的方法進(jìn)行微生物分離和蛋白質(zhì)含量的測定。

1.4.3 總脫氫酶活性的測定

參考Humeyan等［12］的方法并改進(jìn)。具體操作過程為:取100目尼龍布過濾的新鮮瘤胃液2 mL于試管中，加入0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)，對照管先加入5 mL異丙醇。在厭氧條件下恒溫水浴(38～39℃)10 min。然后在試驗(yàn)管中加入5 mL異丙醇終止反應(yīng)?；旌虾?，以4 000×g離心 10 min。上清液稀釋 15倍，于UV-2401PC分光光度計(jì)在485 nm處比色測定吸光度(A485nm)。以38.5℃、pH 6.8條件下，每分鐘引起測定液吸光度上升0.1的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.4.4 轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性分別采用谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶微板法試劑盒測定，樣品處理方法參照試劑盒說明書，采用美國MD-Spectra-Max M5臺式酶標(biāo)儀測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件中compare mean的one-way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同脂肪酸對微生物活力的影響

由表2可知，各組總脫氫酶活性隨采樣時(shí)間的整體變化呈現(xiàn)先升高，后降低的趨勢。各組總脫氫酶活性平均值順序?yàn)?α-亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組＞二十碳五烯酸組＞花生四烯酸組＞硬脂酸組＞對照組，且α-亞麻酸組總脫氫酶活性在3～24 h培養(yǎng)過程中均高于其他試驗(yàn)組和對照組。

在各采樣時(shí)間，3、6和9 h油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸(除9 h外)、二十碳五烯酸組總脫氫酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，3和9 h硬脂酸組和對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。12和18 h除花生四烯酸和硬脂酸組外，各試驗(yàn)組總脫氫酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，并以α-亞麻酸組最高。24 h亞油酸、α-亞麻酸組總脫氫酶活性均顯著高于其他各組(P＜0.05)，油酸、硬脂酸組和對照組之間差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于花生四烯酸和二十碳五烯酸組(P＜0.05)。

由表3可知，各組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性平均值順序?yàn)?花生四烯酸組＞二十碳五烯酸組＞α-亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組＞對照組＞硬脂酸組，亞油酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸組之間差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于對照組和硬脂酸組(P＜0.05)。

在各采樣時(shí)間，除0 h外，油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于對照組和硬脂酸組(P＜0.05)。其中3和12 h以二十碳五烯酸組最高;6和9 h以花生四烯酸組最高，二十碳五烯酸、亞油酸、α-亞麻酸、油酸組依次降低，在各組間有顯著性差異(P＜0.05)。

由表4可知，各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性平均值順序?yàn)?花生四烯酸組＞二十碳五烯酸組＞α-亞麻酸組＞油酸組＞亞油酸組＞對照組＞硬脂酸組，其中花生四烯酸和二十碳五烯酸組顯著高于其他各組(P＜0.05);油酸、亞油酸和α-亞麻酸組間差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于對照組和硬脂酸組(P＜0.05)。

在各采樣時(shí)間，除0和12 h外，油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對照組和硬脂酸組(P＜0.05);硬脂酸組與對照組之間差異不顯著(P＞0.05);除3、6、9 h外，其他采樣時(shí)間以花生四烯酸組最高。

2.2 不同脂肪酸對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表5可知，各組的pH變化范圍依次為6.53～6.68、6.55 ～6.67、6.54 ～6.70、6.55 ～6.68、6.56 ～6.70、6.55 ～6.68、6.55 ～6.68;體外發(fā)酵的pH整體變化范圍在6.53～6.70，并且各組間均差異不顯著(P＞0.05)。

在各采樣時(shí)間，pH隨采樣時(shí)間的變化呈現(xiàn)先升高后降低，最后再上升的趨勢，各組在3 h達(dá)到最大值，除了硬脂酸、亞油酸組外，其他組在12 h達(dá)到最小值。

表2 不同脂肪酸對總脫氫酶活性的影響Table 2 Effects of different fatty acids on activity of total dehydrogenase U/mL

表3 不同脂肪酸對谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Table 3 Effects of different fatty acids on activity of glutamic-oxal(o)acetic transaminase IU/L

表4 不同脂肪酸對谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Table 4 Effects of different fatty acids on activity of glutamic-pyruvic transaminase IU/L

表5 不同脂肪酸對pH的影響Table 5 Effects of different fatty acids on pH

由表6可知，各組氨氮濃度隨采樣時(shí)間的整體變化呈現(xiàn)0～3 h快速上升、3 h達(dá)到一個(gè)峰值、3～9 h下降、9～24 h緩慢上升的趨勢，在3～9 h亞油酸和α-亞麻酸組氨氮濃度下降較其他各組快。各組氨氮濃度平均值順序?yàn)?對照組＞硬脂酸組＞二十碳五烯酸組＞花生四烯酸組＞油酸組＞亞油酸組＞α-亞麻酸組。

在各采樣時(shí)間，3和6 h對照組和硬脂酸組氨氮濃度差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于其他各試驗(yàn)組(P＜0.05)。9 h對照組和硬脂酸組氨氮濃度差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于其他各試驗(yàn)組(P＜0.05);花生四烯酸和二十碳五烯酸組差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于α-亞麻酸、亞油酸、油酸組(P＜0.05);α-亞麻酸組在此時(shí)間達(dá)到最低水平。12 h對照組和硬脂酸組氨氮濃度差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于其他各試驗(yàn)組(P＜0.05);α-亞麻酸、亞油酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸組差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于油酸組(P＜0.05)。18 hα-亞麻酸組氨氮濃度顯著低于其他各組(P＜0.05)。

表6 不同脂肪酸對氨氮濃度的影響Table 6 Effects of different fatty acids on concentration of NH3-N mg/dL

2.3 不同脂肪酸對瘤胃微生物蛋白質(zhì)含量的影響

由表7可知，微生物蛋白質(zhì)含量隨采樣時(shí)間的整體變化呈現(xiàn)0～3 h下降、3～9 h升高、9～24 h下降的趨勢。各組微生物蛋白質(zhì)含量平均值順序?yàn)?α-亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組＞硬脂酸組＞對照組＞二十碳五烯酸組＞花生四烯酸組。

在各采樣時(shí)間，0 h各組間微生物蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P＞0.05)。3 h微生物蛋白質(zhì)含量平均值順序?yàn)?對照組＞硬脂酸組＞亞油酸組＞α-亞麻酸組＞二十碳五烯酸組＞油酸組＞花生四烯酸組，各組間差異顯著(P＜0.05)。6 h微生物蛋白質(zhì)含量平均值順序?yàn)?α-亞麻酸組＞花生四烯酸組＞亞油酸組＞油酸組＞二十碳五烯酸組，各組間差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于對照組和硬脂酸組(P＜0.05)。12 h微生物蛋白質(zhì)含量平均值順序?yàn)?α-亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組，均顯著高于花生四烯酸、二十碳五烯酸、硬脂酸組和對照組(P＜0.05);花生四烯酸、二十碳五烯酸組顯著低于對照組(P＜0.05)。18和24 h微生物蛋白質(zhì)含量緩慢下降至各組最低值。

表7 不同脂肪酸對微生物蛋白質(zhì)含量的影響Table 7 Effects of different fatty acids on microbial protein content mg/mL

3 討論

3.1 不同脂肪酸對瘤胃微生物活力的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶一般在胞內(nèi)的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胞外，但若細(xì)胞受損、胞膜破壞將導(dǎo)致胞外的酶活性上升。在本研究中，各組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨采樣時(shí)間不斷提高，其原因可能是在培養(yǎng)過程中隨時(shí)間的延長微生物與代謝物不斷積累，微生物細(xì)胞自溶導(dǎo)致細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞，從而導(dǎo)致上述酶的釋放增加［13-14］。各不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸)組均顯著高于對照組和硬脂酸組，并隨著不飽和度的增加，變化幅度增大，可能是由于上述不飽和脂肪酸對原蟲或細(xì)菌具有一定的負(fù)效應(yīng)，而且不飽和程度越高其負(fù)效應(yīng)越大所致［6］，其中不飽和度最高的二十碳五烯酸對細(xì)胞的破壞程度最大。

總脫氫酶活性能夠直接反映微生物發(fā)酵時(shí)脫氫酶傳遞氫的能力，即整體微生物的活力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)各組總脫氫酶活性隨著采樣時(shí)間的變化呈現(xiàn)增長的趨勢，之后又有所下降，這與微生物的生長繁殖規(guī)律相一致，即微生物的培養(yǎng)過程中指數(shù)生長期后會進(jìn)入穩(wěn)定期、衰亡期而使微生物活力下降［16-17］。各不飽和脂肪酸組總脫氫酶活性均高于對照組，以α-亞麻酸組活性最高。表明一定比例的不飽和脂肪酸有一定的提高培養(yǎng)液微生物活力的效應(yīng)。這可能是由于其游離脂肪酸的不飽和鍵會抑制原蟲生長［7］，使其群體生物量減少，進(jìn)而減少其對細(xì)菌的吞噬，通過區(qū)系生物量的消長，而最終可能改變微生物的生物總量及微生物總的活力所致［18］。而本試驗(yàn)添加3%的油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸，不飽和度依次增大，相當(dāng)于100 mL培養(yǎng)液中添加水平 分 別 為 0.106、0.107、0.108、0.099、0.099 mmol，但試驗(yàn)結(jié)果顯示處于中等水平的α-亞麻酸組總脫氫酶活性較其他組高，表明脂肪酸一定程度的不飽和度可以通過限制原蟲生長而提高細(xì)菌的數(shù)量;而不飽和鍵數(shù)量較多的花生四烯酸和二十碳五烯酸可能是對原蟲、細(xì)菌的負(fù)作用大于通過抑制原蟲生長提高細(xì)菌數(shù)量的正向作用，也表明了該添加水平致使微生物細(xì)胞的損害程度較大，其適宜的添加水平有待進(jìn)一步的研究。

3.2 不同脂肪酸對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響

pH是反映瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)并受諸多因素的影響［19-20］。瘤胃液pH的正常變化范圍是5.5～7.5，適于微生物生長及其酶類正常的發(fā)酵活動。本研究的pH變化范圍在6.53～6.70，變化不顯著，處在正常范圍內(nèi)。與李鳳學(xué)等［21］、宋志剛等［22］的有關(guān)添加 4%的油脂對培養(yǎng)液pH的影響不顯著的研究結(jié)果相一致，也表明了添加3%的該6種脂肪酸對培養(yǎng)液pH沒有顯著的影響。

氨氮濃度可看作是微生物對含氮化合物的降解及其生長對氨固定利用的綜合指示指標(biāo)。本研究中各組的氨氮濃度基本處于微生物正常生長對氨氮濃度耐受的臨界范圍內(nèi)。各組的氨氮濃度隨采樣時(shí)間呈上升趨勢，并在3 h達(dá)到一個(gè)峰值，可能是微生物對底物中含氮化合物降解所致;而后氨氮濃度的下降則可能是微生物迅速繁殖對氨的利用所致。在培養(yǎng)9 h后氨氮濃度的回升，可能是由于體外培養(yǎng)裝置的簡易，微生物及其降解物不能外排，造成微生物自溶而額外釋放的氨所致［16］。另外，在培養(yǎng)3～9 h，油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸組的氨氮濃度較對照組低，原因可能是不飽和脂肪酸對原蟲的負(fù)作用抑制了原蟲吞噬細(xì)菌的活力，進(jìn)而提高了細(xì)菌的數(shù)量以及活力，加速對氨氮的利用合成菌體蛋白。隨著油酸、亞油酸、α-亞麻酸不飽和度的增加，結(jié)果呈現(xiàn)出氨氮濃度在油酸、亞油酸、α-亞麻酸組依次降低的規(guī)律。α-亞麻酸的不飽和度高于花生四烯酸和二十碳五烯酸，但在培養(yǎng)3～9 h時(shí)，α-亞麻酸組氨氮濃度下降速度較花生四烯酸和二十碳五烯酸組快。這可能是因?yàn)樯鲜龅暮?組脂肪酸過多的不飽和鍵影響了微生物的活力和其正常的發(fā)酵活動所致。

3.3 不同脂肪酸對瘤胃微生物蛋白質(zhì)含量的影響

Dijkstra等［2］認(rèn)為不飽和的長鏈脂肪酸對細(xì)菌有負(fù)作用，但無論其飽和與否對原蟲都有負(fù)作用，并隨不飽和程度的增加其效應(yīng)加大，使其群體生物量減少，類群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而抑制其吞噬細(xì)菌等活動，而表現(xiàn)為區(qū)系間生物量的消長變化［3］，最終可能改變微生物總量。本研究表明，各脂肪酸組的微生物蛋白質(zhì)含量除花生四烯酸組都高于對照組，表明了脂肪酸對微生物蛋白質(zhì)具有一定的調(diào)控作用。本試驗(yàn)中添加的油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸不飽和度依次增大，但試驗(yàn)結(jié)果顯示處于中等水平的α-亞麻酸組微生物蛋白質(zhì)含量較其他組高。這提示不飽和脂肪酸可調(diào)控微生物蛋白質(zhì)含量，但存在著適宜的不飽和程度和一定的添加水平，不飽和程度過高或添加水平過高可能對原蟲、細(xì)菌的負(fù)作用大于通過抑制原蟲生長提高細(xì)菌數(shù)量的正向作用。這一結(jié)果與上述微生物活力的結(jié)果也有一定的一致性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，添加3%的不同脂肪酸對瘤胃微生物活力和微生物蛋白質(zhì)含量具有一定的調(diào)控作用，且以α-亞麻酸效果較好。

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