納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞活性、黏附與細胞因子分泌的影響

尚沁沁 黃 琴 徐 歆 史艷云 李衛(wèi)芬 余東游

(浙江大學動物科學學院飼料科學研究所，農(nóng)業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，杭州 310058)

益生菌是指對人畜有益的活體微生物［1］。外源性益生菌進入腸道后，通過促進機體腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力、維持養(yǎng)殖生態(tài)平衡，最終達到促生長和提高抗病力等益生作用，并具有無毒性、無殘留、無耐藥性以及無環(huán)境污染等優(yōu)點［2］。益生菌主要通過免疫調(diào)節(jié)(增強腸道免疫、活化全身免疫系統(tǒng)及減輕炎癥反應(yīng))［3］和非免疫調(diào)節(jié)(改善腸道微生態(tài)平衡和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu))［4］2種途徑改善動物腸道健康，從而促進動物生長。納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis var.natto)B4是枯草芽孢桿菌的一個亞種［5］，可分解大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時具有抗癌、抗菌、抗氧化、降低膽固醇等功能［6-7］。研究表明，在飼糧中添加納豆芽孢桿菌B4可提高肉雞的平均日采食量和平均日增重［8］，促進仔豬腸道乳酸菌定植［9］，提高魚的非特異性免疫［10］等。目前，關(guān)于益生菌對機體免疫影響的研究多集中于乳酸菌，而針對納豆芽孢桿菌的研究較少。因此，有必要系統(tǒng)、深入地研究飼用納豆芽孢桿菌的作用機理，特別是其提高動物免疫功能的機理。本試驗擬研究納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞活性、黏附與細胞因子分泌的影響，旨在探索該菌株對腸黏膜免疫功能的調(diào)控機理，從而為納豆芽孢桿菌在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

納豆芽孢桿菌B4菌株由浙江大學飼料科學研究所農(nóng)業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室提供;大腸桿菌(Escherichia coli)K88和霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)均購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;Caco-2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑和設(shè)備

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(英國 Oxoid公司);麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司);DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶［含 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)］、D-Hank’s平衡鹽溶液、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司);青、鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所);TritonX-100和臺盼藍染色液(美國Ameresco公司);增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)、白細胞介素 -6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和白細胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測試盒(美國R＆D systems公司);乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為分析純。

5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);HERAcell 150 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron公司);CX41-12C02奧林巴斯倒置顯微鏡(日本Olympus公司);SpectraMax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司);UV-2100紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);XSZ-N107CCD光學顯微鏡(寧波永新光學股份有限公司);DK-8D恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司);SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗細胞及菌株的培養(yǎng)

按照文獻［11］的方法培養(yǎng)細胞及試驗菌株。Caco-2細胞接種在75 cm2細胞培養(yǎng)瓶，以含10%FBS和雙抗(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細胞貼壁生長為單層細胞后(5～7 d)，加入0.5 mL 0.25%的胰酶消化傳代。

-80℃保存的納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌分別經(jīng)LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基活化后，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌2次，最后重懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細菌的濃度為2×108CFU/mL。

1.3.2 細胞活性檢測［12］

Caco-2細胞以1×106個/mL接種于細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞重新貼壁，試驗組分別加入納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌液(1×108CFU/mL)，對照組加等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)共培養(yǎng)，分別進行臺盼藍排斥試驗和LDH細胞毒性檢測。

臺盼藍排斥試驗:分別在共培養(yǎng)1、3、6 h后，以0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以體積比9∶1混合均勻，取少量以細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞(未著色細胞)數(shù)、細胞總數(shù)，計算細胞存活率。

LDH細胞毒性檢測:共培養(yǎng)12 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，以LDH測試盒檢測胞外LDH活性，以此確定細胞的損傷程度。

1.3.3 細菌黏附試驗

按照文獻［13］和［14］的方法熒光標記細菌:試驗菌(1×109CFU/mL)懸浮于1 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)中，37℃暗處作用2 h，PBS洗滌數(shù)次去除未結(jié)合的FITC，重新懸浮于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并調(diào)整菌液濃度至2×108CFU/mL。Caco-2細胞以1×106個/mL接種于細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞重新貼壁，分別進行單菌黏附和黏附抑制試驗［11］。

單菌黏附試驗:FITC標記的大腸桿菌K88或霍亂沙門氏菌(1×108CFU/mL)處理Caco-2細胞1 h，無菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細胞，酶標儀測定其相對熒光強度(RFU)，激發(fā)光波長為494 nm，發(fā)射光波長為520 nm，計算黏附率。

式中:A為每毫升細胞懸液的RFU;A0為每毫升FITC標記菌液的RFU。

黏附抑制試驗:1)競爭試驗，同時加入未熒光標記的納豆芽孢桿菌B4與FITC標記的大腸菌K88或者霍亂沙門氏菌(均為1×108CFU/mL)處理Caco-2細胞1 h后，無菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細胞，酶標儀測定其RFU，計算黏附率。2)排斥試驗，未標記熒光的納豆芽孢桿菌B4(1×108CFU/mL)先處理 Caco-2細胞 1 h后，無菌PBS洗滌3次，再加入FITC標記的大腸菌K88或者霍亂沙門氏菌(1×108CFU/mL)處理1 h，無菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細胞，酶標儀測定其RFU，計算黏附率。3)置換試驗，F(xiàn)ITC標記的大腸菌K88或者霍亂沙門氏菌(1×108CFU/mL)處理Caco-2細胞1 h，無菌PBS洗滌3次，再加入未熒光標記的納豆芽孢桿菌B4處理1 h，胰酶消化收集細胞，酶標儀測定其RFU，計算黏附率。

1.3.4 細胞因子分泌檢測

Caco-2細胞以1×106個/mL接種于細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞重新貼壁，試驗組分別以納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌液(1×108CFU/mL)處理12 h，對照組加等量含10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)基，收集細胞培養(yǎng)上清，以ELISA測試盒檢測其中促炎細胞因子(APRIL、IL-6、IL-8)和抗炎細胞因子(IL-10)的含量，按說明書操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件作統(tǒng)計學分析，用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞活性的影響

由表1可知，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌與Caco-2細胞共培養(yǎng)后，隨共培養(yǎng)時間的延長，細胞存活率逐漸降低，分別從1 h的88.17%和88.67%降低到6 h的72.83%和72.50%，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌組Caco-2細胞的存活率極顯著低于對照組(P＜0.01);納豆芽孢桿菌B4與Caco-2細胞共培養(yǎng)1、3、6 h后，對Caco-2細胞的存活率無顯著影響(P＞0.05)，且Caco-2細胞的存活率極顯著高于上述2株病原菌(P＜0.01)。

表1 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對Caco-2細胞存活率的影響Table 1 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on survival rate of Caco-2 cells %

由表2可知，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌與Caco-2細胞共培養(yǎng)12 h后胞外LDH活性分別是對照組的8.1倍和7.9倍，差異均極顯著(P＜0.01)。納豆芽孢桿菌B4與Caco-2細胞共培養(yǎng)12 h后胞外LDH活性極顯著高于對照組(P＜0.01)，但極顯著低于大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌組(P＜0.01)。

2.2 納豆芽孢桿菌B4對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞的影響

由表3和表4可知，在競爭試驗、排斥試驗和置換試驗中，納豆芽孢桿菌B4對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞的黏附率無顯著影響(P＞0.05)，表明該芽孢桿菌對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞沒有明顯的阻斷作用。

表2 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對Caco-2細胞胞外LDH活性的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on extracellular LDH activity of Caco-2 cells U/L

表3 納豆芽孢桿菌B4對大腸桿菌K88黏附Caco-2細胞的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4 on adhesion of Escherichia coli K88 to Caco-2 cells %

表4 納豆芽孢桿菌B4對霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞的影響Table 4 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4 on adhesion of Salmonella choleraesuis to Caco-2 cells%

2.3 納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞細胞因子分泌的影響

由表5可知，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌組Caco-2細胞分泌APRIL含量極顯著高于對照組(P＜0.01)，而促炎細胞因子IL-6和IL-8含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)，抗炎細胞因子IL-10含量極顯著低于對照組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞活性的影響

益生菌的安全性是其篩選過程中的基本要求，菌株在最終應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)之前，都必須經(jīng)嚴格的毒性試驗，證明其安全無毒，方可進一步推廣使用。本研究通過聯(lián)合運用臺盼藍排斥試驗和LDH細胞毒性檢測2種方法，分析納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞活性的影響，以此評估該菌株的安全性。LDH僅存在于細胞內(nèi)，當細胞受到損傷時，細胞膜完整性受損，導(dǎo)致其通透性增加，使LDH由胞內(nèi)泄漏至胞外。因此，胞外LDH活性成為衡量細胞破損的指標之一［15］。本試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對Caco-2細胞造成嚴重的細胞損傷，引起胞外LDH活性的極顯著升高，而納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞存在一定的細胞毒性，但遠遠低于大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌。臺盼藍排斥試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌極顯著降低Caco-2細胞的存活率，而納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞的存活率沒有顯著的影響。上述2個試驗結(jié)果均表明，納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞無顯著毒性作用，而大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對Caco-2細胞具有毒性作用。由此可知該芽孢桿菌具有安全性，可選為益生菌。近年來，通過對芽孢桿菌進行安全評估得出有4株芽孢桿菌未發(fā)現(xiàn)具有致病特點［16-17］，本研究結(jié)果與這些研究相似。

表5 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對Caco-2細胞細胞因子分泌的影響Table 5 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on cytokine secretion of Caco-2 cells

3.2 納豆芽孢桿菌B4對致病菌黏附的影響

芽孢桿菌制劑具有防病抗病、提高動物生產(chǎn)性能及對動物無毒無害、無殘留等特點，是一種優(yōu)質(zhì)、高效、低殘留、無污染、綠色環(huán)保的新型飼料添加劑。對于益生菌的作用機理，目前普遍認為黏附是其發(fā)揮益生作用的前提，也是細菌與宿主相互作用的第1步［18-19］。Caco-2細胞是體外培養(yǎng)的腸上皮細胞，來源于人結(jié)腸腺癌細胞，在體外培養(yǎng)時，可自發(fā)進行形態(tài)學和生化學上的分化，其結(jié)構(gòu)、形態(tài)學、標志酶的功能表達與腸上皮細胞類似，表現(xiàn)出成熟的腸上皮細胞的特性［20］，現(xiàn)普遍以Caco-2細胞為模型進行體外模擬試驗，并以此來近似反映益生菌在體內(nèi)腸黏膜的黏附特性［21-24］。郭彤等［25］研究表明，大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌均對Caco-2細胞有很強的黏附性。因此，阻止大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附是抵抗其入侵的重要途徑之一。本研究表明，在競爭試驗、排斥試驗和置換試驗中，納豆芽孢桿菌B4對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞的黏附率無顯著影響，對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞未顯示顯著的阻斷作用。Matija?ic＇等［26］研究表明，格氏乳桿菌能通過排斥作用和競爭作用抑制大腸桿菌K88黏附Caco-2細胞，但不影響大腸桿菌K88對豬的空腸組織黏附能力。魏銀萍［27］研究表明，嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌和糞腸球菌能夠抑制大腸桿菌和沙門氏菌對HT-29細胞的黏附能力，但益生菌的黏附力大小并不能決定其抑制致病菌對HT-29細胞黏附作用的強弱，嗜酸乳桿菌的黏附能力比長雙歧桿菌強，但前者對致病菌的黏附抑制作用卻不如后者。Nissena等［18］研究同樣表明，黏附能力高的益生菌不一定具有更強的抵抗致病菌的作用。Wang等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在腸道定植能力弱的乳酸菌，同樣可以減少腸道大腸桿菌的數(shù)量。可見，益生菌的黏附能力及其對致病菌的抗黏附作用并不是其抑制致病菌生長的必要條件，益生菌抑制腸道病原菌的機理比較復(fù)雜，涉及黏附、占位以外的其他機理，這些機理有待于我們進一步討論。

3.3 納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞細胞因子分泌的影響

細胞因子在免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［29］。受細菌或者病毒刺激的組織或細胞可通過釋放細胞因子來活化局部免疫和系統(tǒng)免疫，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型和強度。根據(jù)細胞因子和趨化因子在炎癥反應(yīng)過程中的不同作用，可將細胞因子分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子2類，前者包括白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細胞介素-12(IL-12)、干擾素 -γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)以及趨化因子IL-8等，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生和加劇，提高機體抗感染能力的作用。而白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素 -5(IL-5)、IL-10、白細胞介素-13(IL-13)和轉(zhuǎn)化生長因子 -β(TGF-β)屬于后者，具有抑制和消除炎癥反應(yīng)，維持免疫平衡的作用［30］。

APRIL是TNF家族新成員，具有增強抵抗外來抗原、毒素以及病原微生物入侵的作用。He等［31］和 Macpherson 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，APRIL 是活化腸黏膜免疫應(yīng)答中重要的促炎細胞因子，在正常組織中低表達或不表達，受細菌抗原(整個菌體內(nèi)、毒素或鞭毛)刺激的Caco-2細胞則表達 APRIL。本研究結(jié)果顯示，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌均可極顯著提高Caco-2細胞分泌APRIL的含量，而未受刺激的Caco-2細胞則低表達APRIL。因此，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌均能刺激Caco-2細胞分泌APRIL，從而增強機體對抗外來抗原、毒素以及病原微生物的入侵。Hosoi等［33］研究表明，不同試驗條件會影響納豆芽孢桿菌和大腸桿菌刺激Caco-2細胞分泌IL-6和IL-8。但本試驗未能發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌刺激Caco-2細胞分泌IL-6和IL-8，可能是由于菌株特異性或試驗條件不一樣引起的?？寡准毎蜃覫L-10能夠抑制炎癥應(yīng)答，使免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)向耐受模式，從而能有效控制或治療嚴重的炎癥疾病，具有限制腸上皮細胞對致病菌的免疫應(yīng)答和維持對共生細菌穩(wěn)態(tài)的作用［34］。本試驗表明，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌均可極顯著抑制Caco-2細胞分泌IL-10，從而進一步增強Caco-2細胞的促炎反應(yīng)。因此，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌對促炎細胞因子IL-6和IL-8含量無顯著影響，但能通過顯著提高促炎細胞因子APRIL的含量活化Caco-2細胞促炎反應(yīng)，同時能通過抑制Caco-2細胞分泌IL-10，進一步增強Caco-2細胞的促炎反應(yīng)。

4 結(jié)論

①納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細胞無顯著毒害作用，具有安全性。

②納豆芽孢桿菌B4對大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌黏附Caco-2細胞無阻斷作用。

③納豆芽孢桿菌B4能夠顯著誘導(dǎo)Caco-2細胞分泌促炎細胞因子APRIL并抑制抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生，表明該芽孢桿菌可通過調(diào)節(jié)Caco-2細胞的細胞因子分泌發(fā)揮一定的免疫作用。

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