合成生物學(xué)在推動(dòng)腫瘤細(xì)菌療法臨床藥物開發(fā)中的應(yīng)用

劉陳立 董宇軒 郭 旋

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518055)

2(中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

回顧腫瘤細(xì)菌療法走過(guò)的百年歷程，從最早外科醫(yī)生的偶然發(fā)現(xiàn)(患者感染病原菌后腫瘤生長(zhǎng)得到抑制)[1]，到 William B. Coley 醫(yī)生開發(fā)細(xì)菌制劑 Coley’s Toxins 用于腫瘤治療[2]，再到近二十年研究者通過(guò)基因工程改造細(xì)菌來(lái)提高腫瘤治療效果，細(xì)菌療法在腫瘤治療中一直扮演著重要角色。近年來(lái)，隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，研究者也在思考如何進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤細(xì)菌療法，為腫瘤治療提供更多樣化、更有效安全的策略[3]。

腫瘤細(xì)菌療法依賴自然界中細(xì)菌的毒力、自主運(yùn)動(dòng)能力以及對(duì)腫瘤的趨向性和侵襲能力等特征，使細(xì)菌具有調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力[4]。目前研究者依據(jù)細(xì)菌生物生理功能的不同，為治療腫瘤提供了不同的干預(yù)策略[5]。此外，細(xì)菌基因組簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行工程改造，這也進(jìn)一步提高了細(xì)菌對(duì)環(huán)境感應(yīng)、特異靶向和智能遞送藥物等能力[6]。上述特點(diǎn)賦予細(xì)菌為許多難治性、轉(zhuǎn)移性癌癥類型提供更好的解決方案的能力，加速了腫瘤細(xì)菌治療藥物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研發(fā)進(jìn)程和未來(lái)臨床應(yīng)用成功轉(zhuǎn)化的可能性[7]。

本文從腫瘤細(xì)菌療法面向臨床試驗(yàn)的角度出發(fā)，歸納總結(jié)了梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsp.)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌(Salmonellasp.)和大腸桿菌(Escherichia coli)等不同種屬細(xì)菌在臨床試驗(yàn)中的代表性研究進(jìn)展和面臨的瓶頸問(wèn)題。重點(diǎn)介紹了合成生物學(xué)利用細(xì)菌作為模塊化工程平臺(tái)，設(shè)計(jì)微妙而復(fù)雜的基因線路，在提高細(xì)菌療法有效性和改善臨床生物安全性等方面的應(yīng)用，從而彌補(bǔ)目前腫瘤細(xì)菌療法在臨床測(cè)試中的不足，助力細(xì)菌療法突破瓶頸，推動(dòng)臨床試驗(yàn)進(jìn)展。

2 腫瘤細(xì)菌療法在臨床測(cè)試中的范例

2.1 梭狀芽孢桿菌

梭狀芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，是最大的原核生物屬之一，由于芽孢形態(tài)呈圓形或卵圓形，使菌體膨大呈梭狀，所以被稱為梭狀芽孢桿菌[8]。梭狀芽孢桿菌是專性厭氧菌，因此，賦予了其在氧氣匱乏的實(shí)體腫瘤壞死區(qū)域定植的能力[9]。此外，梭菌芽孢的萌發(fā)是由多種因素導(dǎo)致的，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶、液體靜壓力或陽(yáng)離子表面活性劑等[10]，使其形成具有代謝活性的細(xì)菌細(xì)胞。

目前已有多株梭狀芽孢桿菌被報(bào)道應(yīng)用于治療腫瘤，包括溶組織梭狀芽胞桿菌(C. histolyticum)[11]、破傷風(fēng)梭菌(C. tetani)[12]、溶瘤梭菌(C. sporogenes)[13]和丙酮丁醇梭桿菌(C. acetobutylicum)[14]等。梭狀芽孢桿菌在腫瘤治療中的應(yīng)用歷史可以追溯到 1813 年，外科醫(yī)生 Vautier 首先觀察到腫瘤患者在感染梭狀芽孢桿菌后患上氣性壞疽，但患者體內(nèi)的腫瘤竟然消退了[15]。1935 年，Connell[1]首次使用來(lái)自溶組織梭狀芽胞桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)液干預(yù)治療了 30 例癌癥患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤病情在部分患者上有所緩解。1947 年，Parker 等[16]首次將溶組織梭狀芽胞桿菌用于治療荷瘤小鼠，結(jié)果顯示靜脈注射細(xì)菌激發(fā)小鼠全身性免疫反應(yīng)能在短期內(nèi)延長(zhǎng)小鼠壽命，但腫瘤并沒有完全消退。1955 年，Malmgren 和 Flanigan[17]通過(guò)探究破傷風(fēng)梭菌在小鼠各個(gè)組織器官和瘤內(nèi)的定植數(shù)量，進(jìn)一步證明了梭狀芽孢桿菌對(duì)實(shí)體瘤的特異定植能力。在對(duì)小鼠注射高濃度劑量的破傷風(fēng)梭菌孢子的 48 h內(nèi)，只有在實(shí)體瘤內(nèi)檢測(cè)到了破傷風(fēng)梭菌，這說(shuō)明了細(xì)菌孢子在實(shí)體瘤內(nèi)定植的特異性。以上研究均表明，梭狀芽孢桿菌具備腫瘤治療的潛力。

但由于梭狀芽孢桿菌的天然毒力過(guò)強(qiáng)，其在腫瘤治療中的應(yīng)用也受到一定限制。對(duì)此，Dang等[18]對(duì)包含雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)和梭狀芽孢桿菌在內(nèi)的 26 種不同菌株評(píng)估了其在實(shí)體瘤厭氧區(qū)的特異定植能力。通過(guò)將細(xì)菌或梭菌孢子靜脈注射入 B16 黑色素瘤荷瘤小鼠后，發(fā)現(xiàn)一株諾維氏梭菌(C. novyi)表現(xiàn)出優(yōu)異的定植能力。Dang 等[18]通過(guò)對(duì)該菌株加熱誘導(dǎo)，在 400 多個(gè)細(xì)菌菌落中篩選到缺失致死性毒素基因的減毒株C. novyi-NT，從而降低了梭狀芽孢桿菌在靜脈注射后造成的全身毒性。減毒株C. novyi-NT的孢子僅在小鼠實(shí)體瘤的血管匱乏區(qū)域(厭氧區(qū))出芽萌發(fā)，并破壞周圍的腫瘤細(xì)胞。另外，Dang 等[18]還開發(fā)了一種聯(lián)合溶菌療法(Combination Bacteriolytic Therapy，COBALT)，通過(guò)將C. novyi-NT孢子與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用，顯著延長(zhǎng)了抗腫瘤作用的持續(xù)時(shí)間。這種細(xì)菌聯(lián)合其他療法的治療策略不僅突破了常規(guī)化療藥物無(wú)法深入遞送到血管匱乏的實(shí)體瘤內(nèi)部的瓶頸，也開創(chuàng)了聯(lián)合細(xì)菌治療腫瘤的先河。

雖然目前對(duì)梭狀芽孢桿菌治療腫瘤的機(jī)制尚未清晰，但有研究表明梭菌產(chǎn)生的諸如胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶以及磷脂酶、溶血素和脂肪酶等破壞腫瘤細(xì)胞的毒素可能在腫瘤治療中發(fā)揮了積極作用[19]。另外，也有研究報(bào)道梭菌孢子可以在腫瘤細(xì)胞中萌發(fā)，誘導(dǎo)表達(dá)針對(duì)在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子——缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)[20]和不同細(xì)胞因子如 TNF-α[21]、IL-2[22]和 IL-12[23]，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移[18]。

值得關(guān)注的是，減毒株C. novyi-NT在 2019年完成了 1 期臨床測(cè)試(NCT01924689)。測(cè)試中，對(duì) 24 例過(guò)往接受過(guò)化療或放療等常規(guī)方法且沒有治療效果的晚期實(shí)體腫瘤患者，接受單次瘤內(nèi)注射 6 個(gè)遞增劑量的C. novyi-NT的細(xì)菌孢子(1×104～3×106個(gè)/kg)，以確定劑量限制毒性(DLT)和最大耐受劑量。結(jié)果顯示在 24 名患者中，單次腫瘤內(nèi)注射C. novyi-NT后，10 名患者(42%)的瘤內(nèi)檢測(cè)到細(xì)菌孢子出芽萌發(fā)，并導(dǎo)致腫瘤病灶減小[24]。

2.2 單核細(xì)胞增生性李斯特菌

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性胞內(nèi)桿狀菌。李斯特菌感染會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生多種癥狀，包括腸胃炎、腦膜炎和腦炎[25]。但一般來(lái)說(shuō)，人類免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，能夠有效控制李斯特菌感染。因此，由李斯特菌造成的極其嚴(yán)重的感染通常僅發(fā)生于老年人、孕婦或免疫功能低下的患者[26]。隨著對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌侵染細(xì)胞并激發(fā)強(qiáng)烈細(xì)胞免疫應(yīng)答特性的深入研究，研究者也在考慮利用細(xì)菌的免疫原性來(lái)開發(fā)腫瘤疫苗[26]。

相比于其他細(xì)菌載體可能會(huì)被中和抗體抑制而失去作用，單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染僅會(huì)觸發(fā)適度的體液反應(yīng)，這使其能多次使用來(lái)有效增強(qiáng)患者的 T 細(xì)胞反應(yīng)[19]。值得關(guān)注的是，單核細(xì)胞增生性李斯特菌是激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的有效刺激因子[27]。1962 年，Mackaness[28]報(bào)道了小鼠暴露于亞致死劑量的李斯特菌后，會(huì)產(chǎn)生時(shí)間持久、獨(dú)立于抗體的免疫反應(yīng)，這保護(hù)了未來(lái)致命劑量的李斯特菌的感染?；谶@些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論成果，研究者們開始探索通過(guò)開發(fā)李斯特菌疫苗載體，誘導(dǎo)激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來(lái)清除外源抗原。Schafer 等[29]在 1992年首次報(bào)道了通過(guò)改造李斯特菌載體表達(dá)大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶抗原來(lái)作為腫瘤靶向藥物，誘導(dǎo) BALB/c 小鼠的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。自從這個(gè)開創(chuàng)性的工作成果發(fā)表后，近 30 年來(lái)，基于李斯特菌治療各種癌癥的研究被廣泛報(bào)道。

感染過(guò)程中，單核細(xì)胞增生性李斯特菌會(huì)侵入腸上皮細(xì)胞，隨后細(xì)菌進(jìn)一步遷移到脾臟、肝臟等正常組織器官，并被抗原呈遞細(xì)胞(Antigen-Presenting Cells，APC)吞噬，激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)如促炎細(xì)胞因子表達(dá)增高、李斯特菌特異性激活 CD4＋T 細(xì)胞應(yīng)答和 MHC I 類分子向CD8＋T 細(xì)胞分泌蛋白抗原等[26]。但李斯特菌會(huì)通過(guò)產(chǎn)生穿孔素(Listeriolysin，LLO)和肌動(dòng)蛋白裝配誘導(dǎo)蛋白(Actin Assemble Inducingprotein，ActA)在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散存活[30]。

截至 2014 年，多項(xiàng)李斯特菌腫瘤疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。第一個(gè)推向臨床試驗(yàn)的是應(yīng)用于治療晚期宮頸癌的重組減毒活菌疫苗Lm-LLO-E7[31]。Lm-LLO-E7 是將人乳頭瘤病毒 HPV-16 E7 抗原融合到李斯特菌穿孔素蛋白Listeriolysin O 的非溶血片段，再由李斯特菌分泌表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性。在這項(xiàng) 1 期臨床試驗(yàn)中，對(duì) 15 例既往治療過(guò)的轉(zhuǎn)移性、難治性或復(fù)發(fā)性的晚期浸潤(rùn)性宮頸癌患者進(jìn)行了Lm-LLO-E7 的安全性評(píng)估?；颊呓邮?3 個(gè)劑量水平的Lm-LLO-E7 (1×109CFU、3.3×109CFU 和1×1010CFU)靜脈滴注，3 周后第二次注射。在接受治療之后，所有患者均表現(xiàn)出不良反應(yīng)，包括流感樣綜合征和低血壓等臨床癥狀。到研究實(shí)驗(yàn)結(jié)束，2 例患者死亡、5 例病情有發(fā)展、7 例病情穩(wěn)定、1 例符合部分應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)，該研究首次表明，減毒活疫苗對(duì)晚期浸潤(rùn)性宮頸癌患者是安全的，且對(duì)腫瘤有一定抑制作用[31]。

另外兩個(gè)比較有代表性的李斯特菌疫苗分別是 CRS-207 和 ADXS11-001。其中，CRS-207 是在敲除了兩個(gè)毒力基因actA和內(nèi)化蛋白B (Internalin B)的基礎(chǔ)上，表達(dá)人源間皮素的減毒株。這兩個(gè)毒力基因的缺失降低了細(xì)菌在細(xì)胞間的擴(kuò)散能力和對(duì)非吞噬細(xì)胞的侵襲能力。研究表明，與野生型單核細(xì)胞增生性李斯特菌相比，CRS-207 的定植水平降低了 1 000 倍[32]。在對(duì)CRS-207 的安全性臨床測(cè)試中，17 名間皮瘤、肺癌、胰腺癌或卵巢癌受試者接受 CRS-207 的 4 個(gè)遞增劑量(1×108CFU、3×108CFU、1×109CFU、1×1010CFU)后，患者耐受性良好，并在血清細(xì)胞因子或趨化因子水平觀察到了患者機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活。在 17 名受試者中，37% 的受試者生存期達(dá)到 15 個(gè)月，證明了該疫苗的生物安全性和治療腫瘤的潛力(NCT00585845)。另外，研究者也對(duì) CRS-207 聯(lián)合培美曲塞/順鉑化療的治療有效性做了臨床評(píng)估。共計(jì) 60 例不可手術(shù)切除的惡性胸膜間皮瘤患者接受了 2 次 1×109CFU的 CRS-207 靜脈滴注并聯(lián)合化療。結(jié)果表明，35 例可評(píng)估的患者中，89% (31/35)患者的病情得到控制，1 例完全緩解(3%)，19 例部分緩解(54%)，10 例病情穩(wěn)定(29%)。證明 CRS-207 聯(lián)合化療可顯著改變局部腫瘤微環(huán)境，激活機(jī)體免疫細(xì)胞殺傷腫瘤(NCT01675765)[33]。

2.3 沙門氏菌

沙門氏菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性胞內(nèi)桿狀菌。沙門氏菌能夠在有氧條件下利用氧氣或者在無(wú)氧條件下利用其他電子受體或以發(fā)酵的方式產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，維持自身生理生長(zhǎng)。沙門氏菌擁有諸多優(yōu)良特性，使其成為腫瘤治療中的模式微生物，包括依賴其鞭毛的自主運(yùn)動(dòng)能力、便于基因改造、天然的細(xì)菌毒力等[37]。

由于在臨床上使用沙門氏菌具有高感染風(fēng)險(xiǎn)，所以如何平衡細(xì)菌過(guò)強(qiáng)的毒性和治療效力是研究者急需攻克的難題。目前研究者對(duì)沙門氏菌進(jìn)行了多方面的基因工程改造。已報(bào)道的改造主要集中于降低細(xì)菌天然毒力、提高細(xì)菌腫瘤定植能力和降低細(xì)菌逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)控的風(fēng)險(xiǎn)等，如鼠傷寒沙門氏菌菌株 VNP20009[38]、A1-R[39]和ΔppGpp (SHJ2037)[40]等。

其中，VNP20009 是基于野生型鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 底盤，通過(guò)基因工程改造的方式敲除了msbb基因，使細(xì)菌喪失了將脂質(zhì)?；癁閮?nèi)毒素的能力，從而減少了內(nèi)毒素的產(chǎn)生，降低了細(xì)菌毒性。另外，通過(guò)敲除參與嘌呤代謝相關(guān)基因purI，使細(xì)菌的增殖只能依賴于外源性的腺嘌呤，避免了細(xì)菌逃逸風(fēng)險(xiǎn)[20]。鼠傷寒沙門氏菌菌株 A1-R 是在結(jié)腸癌小鼠模型中篩選得到的亮氨酸和精氨酸缺陷株，其在實(shí)體瘤壞死區(qū)有較強(qiáng)的定植能力[41]，并對(duì)前列腺癌[42]、乳腺癌[43]和宮頸癌[44]等都有很好的療效。ΔppGpp(SHJ2037)是relA和spoT雙基因突變菌株，relA和spoT的缺失導(dǎo)致了細(xì)菌不能合成 ppGpp，從而喪失了細(xì)菌對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的侵襲能力。有文章報(bào)道 ΔppGpp (SHJ2037)在小鼠結(jié)腸癌模型中具有良好的靶向能力，并改造其表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白(Cytolysin A)，在小鼠原位瘤模型和肺轉(zhuǎn)移瘤模型中表現(xiàn)出良好的治療效果[45]。

在上述菌株中，VNP20009 是首例推向腫瘤治療臨床測(cè)試的沙門氏菌菌株。據(jù)報(bào)道，VNP20009 在 1 期安全性臨床測(cè)試中，對(duì) 24 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者和 1 名轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者靜脈注射 106～109CFU/m2的 VNP20009；結(jié)果表明，患者的最大耐受劑量為 3×108CFU/m2，在接受 109CFU/m2的注射劑量后，患者出現(xiàn)嚴(yán)重的劑量限制毒性，表現(xiàn)為血小板減少、貧血、持續(xù)性菌血癥、高膽紅素血癥、腹瀉、嘔吐、惡心、堿性磷酸酶升高和低磷酸鹽血癥等。雖然 VNP20009 在臨床測(cè)試中表現(xiàn)出良好的腫瘤定植能力，但并沒有觀察到病灶減小。因此，VNP20009 由于在臨床實(shí)驗(yàn)中不具備有效的腫瘤治療效果而止步于 1 期[46]。

2.4 益生菌——大腸桿菌 Nissle 1917

大腸桿菌菌株 Nissle 1917(Escherichia colistrain Nissle 1917，EcN)由外科醫(yī)生 Alfred Nissle于 1917 年在第一次世界大戰(zhàn)期間從一名德國(guó)士兵的糞便中分離出來(lái)。之后，Alfred Nissle 發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)不同致病性大腸桿菌具有強(qiáng)烈的拮抗活性[47]。

EcN 作為腸道益生菌具有許多優(yōu)良的特性，賦予了其應(yīng)用于腫瘤治療的良好前景。首先，EcN 具有生物安全性、對(duì)免疫系統(tǒng)敏感[48]，不產(chǎn)生任何與致病性大腸桿菌相關(guān)的腸毒素或細(xì)胞毒素[49]。同時(shí)，EcN 膜上的血清敏感性脂多糖可確保該菌株能快速地被機(jī)體清除，且對(duì)患者沒有嚴(yán)重的免疫毒性副作用[50]。而 EcN 作為兼性厭氧菌，同樣具備良好的實(shí)體瘤定植能力[6]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道表明 EcN 能夠作為細(xì)菌藥劑治療腫瘤。例如，Zhang 等[51]報(bào)道了改造 EcN 組成型表達(dá)天青蛋白以抑制腫瘤的研究。在該研究中，患有原位 B16 黑色素瘤或 4T1 乳腺腫瘤的 BALB/c 小鼠以每只 2×107CFU 的劑量靜脈注射 EcN，天青蛋白的釋放和由此產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移，并且細(xì)菌沒有表現(xiàn)出顯著的毒性。另外，He 等[52]通過(guò)氧氣依賴性啟動(dòng)子控制 EcN 在實(shí)體瘤內(nèi)特異性表達(dá)血管生成抑制劑 Tum-5。結(jié)果表明，在靜脈注射的 14 天內(nèi)，表達(dá) Tum-5 的 EcN 能在攜帶B16 黑素瘤的 C57BL/6 小鼠中定植，并且腫瘤生長(zhǎng)和血管生成被成功抑制。此外，該課題組還將能夠表達(dá)抗癌蛋白 p53 的治療模塊加入到表達(dá)Tum-5 的 EcN 中，賦予了 EcN 在小鼠原位肝癌腫瘤模型上更顯著的抑制作用[6]。

目前，EcN 在腫瘤治療臨床測(cè)試上走得最遠(yuǎn)的是美國(guó) Synlogic 公司研發(fā)的 SYNB1891。SYNB1891 是以大腸桿菌 Nissle 1917 為細(xì)菌底盤，利用其在腫瘤內(nèi)的特異性定植能力，通過(guò)合成生物學(xué)改造，賦予 EcN 在瘤內(nèi)特異性表達(dá)STING 激動(dòng)劑環(huán)二磷酸腺苷。STING 激動(dòng)劑可以激活抗原呈遞細(xì)胞呈遞腫瘤抗原，從而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)[53]。SYNB1891 對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤和淋巴瘤患者(NCT04167137)的 1 期臨床實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出良好的安全性；同時(shí)，患者在接受SYNB1891 干預(yù)后，顯示出 STING 通路激活，以及相關(guān)干擾素刺激基因、趨化因子、細(xì)胞因子和 T 細(xì)胞應(yīng)答等上調(diào)；另外，2 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌治療的患者接受治療后，腫瘤也得到了持久穩(wěn)定的控制[54]。這一臨床測(cè)試結(jié)果證明了 SYNB1891 的安全性和腫瘤治療的有效性，同時(shí)也有望彌補(bǔ)免疫療法對(duì)大部分患者沒有良好響應(yīng)的缺陷。

2.5 卡介苗

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是由來(lái)自法國(guó)巴斯德研究所的 Charles Calmette 和Camille Guérin 根據(jù)減毒的牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)懸液制成的活細(xì)菌制劑。他們通過(guò)將牛型結(jié)核分枝桿菌在含有膽汁的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)分岐桿菌的減毒，并在傳代超過(guò) 1 000 次后獲得了供臨床使用的減毒菌株[55]。

起初，卡介苗的作用是為了治療哮喘性支氣管炎及預(yù)防結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎[56]，直到 1959 年，卡介苗首次用于癌癥免疫治療，并在治療及預(yù)防腫瘤中取得了很好的效果。1976年，卡介苗治療佐劑首次成功應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)性淺表性膀胱癌，這是具有劃時(shí)代意義的研究成果[57]。隨后，卡介苗于 1990 年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床治療[41]。直至 40 年后的今天，卡介苗已成為復(fù)發(fā)性淺表性膀胱癌治療中最常用的佐劑。

雖然卡介苗治療腫瘤的機(jī)理尚無(wú)定論，但主流的觀點(diǎn)認(rèn)為卡介苗是通過(guò)激活局部和全身的免疫反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤效果[42]。研究表明，卡介苗通過(guò)灌注的方式進(jìn)入膀胱后，激活尿路上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，產(chǎn)生 IL-1β、IL-8、IL-15 和 IL-18 等細(xì)胞因子以及 CXC 趨化因子配體 10 (CXCChemokine Ligand 10，CXCL10)、GM-CSF等趨化因子，從而吸引中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞和 CD8＋T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的募集[43-44]，這些免疫細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生活性氧中間體或釋放促凋亡因子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用[57]。同時(shí)也有研究表明，腫瘤浸潤(rùn)性 CD4＋T 細(xì)胞數(shù)量的增加、CD4＋T 細(xì)胞與 CD8＋T 細(xì)胞比率的增加都和腫瘤的治療效果顯著相關(guān)[58]。

3 合成生物學(xué)推動(dòng)腫瘤細(xì)菌療法的臨床開發(fā)

截至 2021 年，雖然已有多種細(xì)菌治療腫瘤的案例報(bào)道(表 1)，其中以卡介苗為代表的腫瘤細(xì)菌療法在治療和預(yù)防淺表性膀胱癌方面效果顯著、臨床安全，使其在諸多處于臨床前研究和臨床測(cè)試階段的活菌制劑中脫穎而出，成為腫瘤細(xì)菌療法的典范(圖 1)[55]。但就目前來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)菌療法在臨床開發(fā)中面臨著兩方面的關(guān)鍵挑戰(zhàn)：一是如何在保證活菌藥物生物安全性的前提下，提高細(xì)菌的腫瘤治療能力[59]。傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)不能系統(tǒng)性地修飾細(xì)菌功能，從而不能很好地平衡細(xì)菌毒力和腫瘤治療效力之間的關(guān)系。例如，VNP20009 雖然降低了沙門氏菌天然毒力，避免了細(xì)菌毒副作用，但卻損失了細(xì)菌對(duì)腫瘤的抑制效果[46]。挑戰(zhàn)二是解析細(xì)菌治療腫瘤的現(xiàn)象背后潛藏的治療機(jī)理，活菌藥物是如何對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用的，至今仍是一個(gè)待解之迷。腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，活菌制劑的不可控性都給更深入的分子機(jī)理研究帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

圖1 治療腫瘤細(xì)菌在臨床前和臨床試驗(yàn)中的進(jìn)展情況Fig. 1 Progress in preclinical and clinical trials for the bacterial therapeutics

表1 腫瘤細(xì)菌療法在臨床測(cè)試中的范例Table 1 Examples of bacterial therapeutics in clinical trial

近年來(lái)，合成生物學(xué)作為一門以理性設(shè)計(jì)生物行為為目標(biāo)的學(xué)科快速發(fā)展，已成為更復(fù)雜、更精確地設(shè)計(jì)細(xì)菌行為的重要方法[60]。這種方法利用細(xì)菌作為模塊化的工程平臺(tái)，將基因和啟動(dòng)子元件合理設(shè)計(jì)組合，創(chuàng)造出微妙而復(fù)雜的基因線路，從而能夠更精確地控制細(xì)菌的生理行為，加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的生物安全控制，調(diào)控細(xì)菌表達(dá)治療分子的釋放，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)疾病的治療能力等(圖 2)[61]。因此，合成生物學(xué)有望成為細(xì)菌療法臨床開發(fā)的助推劑，面對(duì)腫瘤細(xì)菌療法在臨床測(cè)試中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，提高細(xì)菌制劑的研發(fā)質(zhì)量，強(qiáng)力推動(dòng)腫瘤細(xì)菌療法走向臨床應(yīng)用。

圖2 合成生物學(xué)推動(dòng)腫瘤細(xì)菌療法的臨床開發(fā)Fig. 2 Synthetic biology in promoting clinical advances of bacterial anti-cancer therapy

3.1 面向臨床的生物安全性

目前，通過(guò)基因工程改造能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)菌減毒或構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，從而限制細(xì)菌向正常組織器官擴(kuò)散。這一策略在臨床前藥理學(xué)和毒理學(xué)測(cè)試中均顯示出不錯(cuò)的安全性[62-63]。然而，為了獲得更好的防治細(xì)菌逃逸效果，研究者并不僅僅滿足于此。根據(jù)實(shí)體瘤內(nèi)氧氣濃度比正常組織低的特性，Li 等[64]利用氧氣敏感啟動(dòng)子元件設(shè)計(jì)了一套基于“自殺開關(guān)”的合成生物學(xué)基因線路，構(gòu)建了一株僅能在瘤內(nèi)定植的專性厭氧鼠傷寒沙門氏菌 YB1，由此規(guī)避細(xì)菌的逃逸風(fēng)險(xiǎn)。他們首先利用厭氧啟動(dòng)子 PpepT 驅(qū)動(dòng)必需基因asd轉(zhuǎn)錄表達(dá)，再用需氧啟動(dòng)子 PsodA 反向驅(qū)動(dòng)asd的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn) PsodA 對(duì) PpepT 啟動(dòng)子本底表達(dá)的抑制作用，確保一旦細(xì)菌逃脫瘤內(nèi)擴(kuò)散到正常組織，高氧氣的環(huán)境會(huì)誘導(dǎo) PsodA 抑制必需基因asd的表達(dá)，從而使細(xì)菌因不能合成細(xì)胞壁而“自殺”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在乳腺癌裸鼠模型中，YB1 在瘤內(nèi)的定植數(shù)量要顯著高于正常組織器官內(nèi)的數(shù)量[64-65]。

此外，上述報(bào)道的活菌制劑 SYNB1891 不僅利用了厭氧啟動(dòng)子 Pfnrs驅(qū)動(dòng) STING 激動(dòng)劑環(huán)二磷酸腺苷基因dacA在瘤內(nèi)的特異表達(dá)，還敲除了細(xì)菌胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因thyA和大腸桿菌合成細(xì)胞壁的關(guān)鍵基因dapA。相比于正常組織，實(shí)體瘤內(nèi)的胸腺嘧啶核苷酸合成酶的濃度比較豐富，這就使得細(xì)菌在缺失thyA基因的情況下僅能在瘤內(nèi)定植和復(fù)制；同時(shí)，細(xì)菌dapA基因的缺失使細(xì)菌喪失了合成細(xì)胞壁的能力，從而使細(xì)菌在進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)逐漸被免疫細(xì)胞清除。這種對(duì)細(xì)菌關(guān)鍵基因的“雙敲除策略”更近一步提高了細(xì)菌的生物安全性，大大降低了安全風(fēng)險(xiǎn)，也促使 SYNB1891 能夠在臨床安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中取得成功[49]。

另一種通過(guò)合成生物學(xué)理念增強(qiáng)細(xì)菌療法臨床安全性的策略是由 Ho 等[66]開發(fā)的“合成生物學(xué)食用療法”。通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)重新編程EcN，使細(xì)菌能夠在腸道組成型表達(dá)組蛋白樣蛋白 A(Histone-like protein A，HlpA)。其中，組蛋白樣蛋白 A 能特異結(jié)合結(jié)直腸癌細(xì)胞上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycan，HSPG)，同時(shí) EcN 通過(guò)表達(dá)分泌黑芥子酶可以將患者食用的西蘭花中的天然成分硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)轉(zhuǎn)化為抗癌小分子蘿卜硫素(Sulphoraphane)。在小鼠結(jié)直腸癌模型的研究顯示，該方法對(duì)鼠源和人源結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率高達(dá) 95%。這種將可食用的西蘭花和“益生菌酸奶”的聯(lián)合療法實(shí)現(xiàn)了將日常食物轉(zhuǎn)化為癌癥預(yù)防及治療的藥物分子，進(jìn)一步確保了生物安全性。

3.2 提高腫瘤治療的有效性

細(xì)菌可以用于治療腫瘤的一個(gè)重要原因是其能夠作為免疫激活劑扭轉(zhuǎn)瘤內(nèi)的免疫抑制微環(huán)境。早在 150 年前，William B. Coley 研制的滅活細(xì)菌制劑——Coley’s Toxins 從某種程度上來(lái)講可能就是利用病原微生物進(jìn)入體內(nèi)后，打破體內(nèi)原本“沉寂”的免疫微環(huán)境，激活免疫細(xì)胞殺傷細(xì)菌的同時(shí)也消滅癌細(xì)胞，從而對(duì)惡性腫瘤達(dá)到“以毒攻毒”的治療效果。因此，研究者將Coley 稱為“癌癥免疫療法之父”[67]。

合成生物學(xué)“自下而上”的設(shè)計(jì)理念，給予科學(xué)家極大的便利，通過(guò)改造細(xì)菌作為遞送藥物的智能載體，實(shí)現(xiàn)藥物分子在瘤內(nèi)不同層次的遞送，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療腫瘤的目的[3]。目前已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌可遞送藥物分子，包括溶血素 A(ClyA)、FAS 配體(FASL)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)等細(xì)胞毒性分子，IL-2、IL-18、CCL21 等細(xì)胞因子，以及 p53 等調(diào)控因子等[61]。其中，Zheng 等[68]基于鼠傷寒沙門氏菌 ΔppGpp 開發(fā)的一種組成型“智能”載藥平臺(tái)，能夠使其表達(dá)及分泌創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)鞭毛蛋白 FlaB，通過(guò) FlaB 協(xié)同活化TLR5 和 TLR4 信號(hào)通路，提高腫瘤抑制因子的分泌，顯著增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。另外，為了改善細(xì)菌本身治療腫瘤效果不佳的問(wèn)題，本文作者團(tuán)隊(duì)[69]提供了一種細(xì)菌與光熱納米顆粒的聯(lián)合治療策略。通過(guò)將光熱納米顆粒 INPs 偶聯(lián)在減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株 YB1上，開發(fā)出能夠感應(yīng)外界紅外光強(qiáng)的“合成溶瘤菌”。相比于未結(jié)合納米顆粒的對(duì)照菌株，細(xì)菌在瘤內(nèi)的定植數(shù)量提高了 14 倍。同時(shí)，這種聯(lián)合療法不僅能夠?qū)?xì)菌和腫瘤進(jìn)行示蹤和成像，還能有效提高對(duì)較大膀胱癌實(shí)體瘤(＞500 mm3)的治療效果。提高工程細(xì)菌在瘤內(nèi)的群體定植能力是實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的關(guān)鍵步驟，但目前關(guān)于工程細(xì)菌定植能力的理性設(shè)計(jì)尚缺乏理論指導(dǎo)。基于合成生物學(xué)造物致知的理念，本文作者團(tuán)隊(duì)[70]以大腸桿菌 MG1655 為模式生物，系統(tǒng)研究了細(xì)菌空間定植的進(jìn)化穩(wěn)定性策略，發(fā)現(xiàn)種群在不同大小生境的定植，都對(duì)應(yīng)著一個(gè)最優(yōu)的遷徙和生長(zhǎng)策略，這為未來(lái)理性設(shè)計(jì)工程細(xì)菌瘤內(nèi)空間定植提供了重要的科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)的理論指導(dǎo)。邏輯門控系統(tǒng)是合成生物學(xué)最具標(biāo)志性的基因線路之一。邏輯門控系統(tǒng)有助于改造細(xì)菌實(shí)現(xiàn)其對(duì)兩個(gè)或多個(gè)輸入腫瘤相關(guān)信號(hào)的整合，以便特異表達(dá)具有治療效果的功能性基因的輸出，實(shí)現(xiàn)其在腫瘤診斷、預(yù)防和治療方面的高度選擇性應(yīng)用場(chǎng)景[71]。Anderson 等[72]基于邏輯門控系統(tǒng)成功將大腸桿菌改造成具有腫瘤侵襲能力的合成工程菌。該系統(tǒng)應(yīng)用雙輸入邏輯與門基因線路，設(shè)計(jì)大腸桿菌只有在感知到腫瘤內(nèi)低氧氣濃度和自身群體密度后，才會(huì)特異性輸出表達(dá)來(lái)自假結(jié)核耶爾森菌(Yersinia pseudotuburculosis)的侵染素編碼基因inv，使細(xì)菌能夠侵入包括 HeLa、HepG2 和U2OS 等癌細(xì)胞系。這篇具有里程碑意義的文章開創(chuàng)了合成生物學(xué)優(yōu)化腫瘤細(xì)菌療法的先河，為細(xì)菌療法的優(yōu)化帶來(lái)了更多可能。

另外，為了獲得更好的腫瘤治療效果，可能還需要進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)菌搭載藥物分子可控釋放能力。通過(guò)合成生物學(xué)手段構(gòu)建的群體感應(yīng)基因線路能夠感知環(huán)境因素的變化，完成藥物分子表達(dá)釋放的智能切換，這套對(duì)基因表達(dá)智能精確的時(shí)空控制，有助于實(shí)現(xiàn)可控化的藥物管理策略，增強(qiáng)抗腫瘤效果[73]。根據(jù)上述理念，Din 等[74]和Danino 等[75]構(gòu)建了一套基于細(xì)菌載體表達(dá)抗腫瘤藥物的同步化合成和裂解釋放系統(tǒng)。這套系統(tǒng)不僅能夠維持細(xì)菌在實(shí)體瘤內(nèi)的定植數(shù)量，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，還能在細(xì)菌數(shù)量增多后，完成細(xì)菌菌體的裂解和抗腫瘤藥物的釋放。小鼠實(shí)驗(yàn)顯示，將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)的沙門氏菌與化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)用，可以使小鼠的平均生存時(shí)間增加約 50%，療效提高正是得益于系統(tǒng)藥物釋放的同步周期性和穩(wěn)定性[74]。

應(yīng)用同樣的思路，該課題組通過(guò)改造一株非致病性大腸桿菌，在腫瘤微環(huán)境中特異性裂解并釋放 CD47 納米抗體拮抗劑達(dá)到治療黑色素瘤的目的。CD47 是一種抗吞噬細(xì)胞受體，通常在幾種人類癌癥組織中過(guò)表達(dá)。研究表明，通過(guò)群體感應(yīng)裂解系統(tǒng)表達(dá) CD47 納米體拮抗劑可增加腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞的激活數(shù)量，刺激腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，從而刺激腫瘤快速消退[76]。另外，該課題組還將群體感應(yīng)裂解釋放系統(tǒng)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法聯(lián)用，通過(guò)設(shè)計(jì) EcN 在瘤內(nèi)特異性周期化裂解表達(dá) PD-L1 和 CTLA-4 拮抗劑，激活增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并在 B 細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型上將腫瘤的抑制效果維持在 15天以上[77]。

4 總結(jié)與展望

雖然目前已有多種細(xì)菌制劑在動(dòng)物模型中被證明具有治療癌癥的潛力，如梭狀芽胞桿菌等專性厭氧菌，或者如沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌和大腸桿菌等兼性厭氧菌，但是這些菌株都還處于臨床前或臨床實(shí)驗(yàn)階段，并沒有達(dá)到預(yù)期的人體臨床試驗(yàn)效果。究其原因，主要是由于活細(xì)菌制劑在臨床評(píng)估中仍有一些挑戰(zhàn)需要克服：

(1)如何確保細(xì)菌治療腫瘤的安全性。將病原菌用于腫瘤治療，可能會(huì)引起全身毒性副作用。確保細(xì)菌在瘤內(nèi)特異性定植的前提下，降低細(xì)菌逃逸風(fēng)險(xiǎn)，是研究者在研發(fā)溶瘤細(xì)菌藥物時(shí)需要優(yōu)先考慮的問(wèn)題。一種新的“合成生物學(xué)防護(hù)策略”是構(gòu)建非天然氨基酸代謝依賴型菌株，使細(xì)菌無(wú)法在代謝途徑上繞過(guò)生物防護(hù)機(jī)制[78]。雖然基因改造可能限制了細(xì)菌的致病性，但并不能保證基因改造模塊的穩(wěn)定性和基因線路的遺傳穩(wěn)定性。因此，在早期臨床試驗(yàn)中，不僅要確保細(xì)菌對(duì)臨床患者的生物安全性，也要確保細(xì)菌不會(huì)感染傳播到密切接觸者。故需要設(shè)置嚴(yán)格詳密的監(jiān)管框架和防護(hù)體系來(lái)規(guī)避上述風(fēng)險(xiǎn)，如樣品采集程序、科學(xué)監(jiān)測(cè)方法、應(yīng)急處理方式等[79]。對(duì)此，F(xiàn)DA 也于 2018 年發(fā)布了一份行業(yè)指南，旨在解決這些問(wèn)題，以幫助研發(fā)者和實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)合理的研究策略[80]。另外，也需要特別考慮前期接受過(guò)常規(guī)放療或化療無(wú)效的癌癥患者，這類免疫系統(tǒng)受損的患者若暴露于細(xì)菌感染，可能會(huì)導(dǎo)致巨大的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生命安全造成不可控的結(jié)果。

(2)如何針對(duì)不同患者確定“個(gè)性化診療標(biāo)準(zhǔn)”。由于不同患者的年齡、身體素質(zhì)、罹患癌癥類型都不相同，如何確立溶瘤細(xì)菌藥物的用藥劑量、用藥周期、給藥后輔助藥劑的選用等，都需要經(jīng)過(guò)謹(jǐn)慎的求證和測(cè)試。特別是在患者腫瘤消退后，如何使用合適的方法來(lái)清除體內(nèi)的細(xì)菌。抗生素可以作為一種行之有效的策略，然而，治療后使用抗生素必須謹(jǐn)慎，因?yàn)檫^(guò)度使用抗生素會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致出現(xiàn)新的安全風(fēng)險(xiǎn)[81]。

(3)如何確定合理的給藥方式。給藥方式的不同也會(huì)造成患者機(jī)體免疫響應(yīng)的差異和副作用水平的不同，靜脈滴注的方式雖然可以確保細(xì)菌制劑快速達(dá)到并定植于腫瘤部位，但也會(huì)對(duì)患者機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，引起敗血癥，危及生命。目前，活細(xì)菌制劑在臨床上的常用給藥方式主要包括口服給藥和局部給藥等，如益生菌產(chǎn)品由于不存在細(xì)菌毒性，一般是選擇口服給藥的方式；但大多數(shù)活細(xì)菌腫瘤治療制劑由于天然毒性的原因，臨床研究者還是會(huì)優(yōu)先采取局部給藥，包括瘤內(nèi)注射、瘤旁注射或如 BCG 一樣采取膀胱灌注的給藥方式[51]。

綜上考慮，從活細(xì)菌腫瘤治療制劑的研發(fā)到臨床前和臨床試驗(yàn)的成功仍然是一段充滿嚴(yán)峻考驗(yàn)的漫漫長(zhǎng)路，還需研究者通過(guò)設(shè)計(jì)更嚴(yán)格、更合理、更科學(xué)的臨床前基礎(chǔ)研究來(lái)逐漸縮短這段距離。而隨著合成生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究的不斷發(fā)展成熟，以及現(xiàn)代生物技術(shù)的日益完善，腫瘤細(xì)菌療法在未來(lái)必將取得重要突破，給癌癥患者帶來(lái)更多康復(fù)的希望，造福社會(huì)，造福于民！