基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧條件下的細(xì)菌單細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)時觀測

馬智鑫 鄧宇芳 于 躍 李思宏 梁 帆 夏 霖* 黃術(shù)強(qiáng)*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院 中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

近年來，得益于 DNA 測序技術(shù)的不斷迭代優(yōu)化，微生物組研究取得了蓬勃發(fā)展[1]。微生物培養(yǎng)方法是微生物相關(guān)研究的絕對基礎(chǔ)，是不可繞開的關(guān)鍵一環(huán)[2]。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法包括選擇培養(yǎng)法、平板單克隆培養(yǎng)法、基于密度/細(xì)胞尺寸篩選法和有限稀釋法等，均為微生物實(shí)驗(yàn)室的常用基礎(chǔ)方法。微生物學(xué)家通過各種培養(yǎng)方法能夠獲得特定細(xì)胞株系的純培養(yǎng)，進(jìn)而為各種細(xì)胞生理學(xué)實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確而充足的研究對象。但由于某些微生物相關(guān)培養(yǎng)方法的缺失，大大阻礙了研究者對其一些基本屬性的認(rèn)知，進(jìn)而影響到相關(guān)生態(tài)以及生物學(xué)現(xiàn)象的研究[3]。

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法所得到的純培養(yǎng)物，理論上應(yīng)是來源于同一菌株，幾乎不存在明顯的遺傳變異[4]，通過對其進(jìn)行測量能夠獲得許多生理學(xué)參數(shù)，包括生長速率、死亡率、細(xì)胞尺寸分布和基因表達(dá)強(qiáng)度等，也能夠獲得類似Monod 方程這樣對工業(yè)生產(chǎn)有著一定指導(dǎo)意義的經(jīng)驗(yàn)公式[5]。而隨著對細(xì)胞生理狀態(tài)噪聲與隨機(jī)波動相關(guān)研究的逐漸深入[6-7]，研究者們越來越意識到細(xì)胞異質(zhì)性的存在與重要性[8]，即從某種角度來講每個單細(xì)胞都可能與其他細(xì)胞有所區(qū)別。若要對細(xì)菌進(jìn)行單細(xì)胞水平的培養(yǎng)與研究，則傳統(tǒng)的群體培養(yǎng)方法已不能滿足要求，需要開發(fā)新的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)技術(shù)[2]。

在細(xì)菌單細(xì)胞水平進(jìn)行生理學(xué)研究的重要技術(shù)手段之一是利用基于微流控技術(shù)的高分辨顯微鏡延時拍攝方法[9]。其中，微流控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)，并且有著高度的可設(shè)計性和對實(shí)驗(yàn)條件的可控性[10]；而顯微鏡延時拍攝方法則是在不影響細(xì)胞生理活動的前提下，實(shí)時采集各種參數(shù)，與“下一代細(xì)菌生理學(xué)技術(shù)”的理念高度符合[11]。目前相關(guān)技術(shù)的報道仍主要集中于常規(guī)條件的有氧培養(yǎng)，對于與人類健康息息相關(guān)的大量厭氧菌與兼性厭氧菌的厭氧生理學(xué)的研究則相對較少。該技術(shù)的主要難點(diǎn)在于既要確保培養(yǎng)裝置的氣密性，又要將整個培養(yǎng)系統(tǒng)(包括微流控裝置、氣體控制裝置等)與相關(guān)商業(yè)化顯微鏡進(jìn)行適配。此外，由于厭氧條件下細(xì)菌生長相對較慢[12]，需要確保整個系統(tǒng)能夠長期穩(wěn)定的運(yùn)行。

本研究提供了一種厭氧微生物培養(yǎng)與實(shí)時觀測裝置。該裝置包括：底座、上蓋、微流控芯片和培養(yǎng)液儲存室。其中，培養(yǎng)裝置上蓋水平面上設(shè)有亞克力板或玻璃板視窗，與微流控芯片底部蓋玻片相對設(shè)置，便于顯微成像；培養(yǎng)基儲液池上設(shè)有出液孔，可與微流控芯片相連為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的營養(yǎng)；培養(yǎng)裝置上蓋的側(cè)壁上設(shè)有氣體入口、氣體出口和出液口，以便維持培養(yǎng)裝置內(nèi)的厭氧氛圍、氣壓穩(wěn)定以及液體的流通。該裝置具有優(yōu)異的氣密性，能夠?yàn)閰捬跷⑸锾峁╅L時間穩(wěn)定的厭氧氣體氛圍且氣體氛圍可控；同時可以滿足高通量、大范圍多位點(diǎn)采樣，高放大倍數(shù)拍攝等實(shí)驗(yàn)需求。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備

2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

微流控芯片制作所用的材料與試劑如表 1 所示；細(xì)菌培養(yǎng)所用的材料與試劑如表 2 所示；單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用的材料與試劑如表 3 所示。

表1 微流控芯片相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料與試劑Table 1 Experimental materials for microfluidics

表2 細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料與試劑Table 2 Experimental materials for bacterial culture

表3 單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料與試劑Table 3 Experimental materials for bacterial culture

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)使用的儀器與設(shè)備如表 4 所示。

表4 儀器與設(shè)備Table 4 Instruments and equipments

2.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株如表 5 所示。

表5 實(shí)驗(yàn)菌株Table 5 Bacterial strains for experiment

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 微流控芯片的設(shè)計

本實(shí)驗(yàn)所使用的微流控芯片被稱為母細(xì)胞芯片(Mother Machine)[14]，即指其關(guān)鍵功能在于將細(xì)菌許多單個母細(xì)胞(Mother Cell)保持在固定位置持續(xù)生長，具體設(shè)計如圖 1 所示。其中，圖 1(a)中單細(xì)胞生長通道總數(shù) 4 000，寬度為 0.8～2.6 μm (以 0.2 μm 的梯度增加)，高度為 1.2 μm，長度為 25 μm；培養(yǎng)基通道寬度為100 μm，高度為 100 μm，箭頭表示其中液體培養(yǎng)基流動。采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的芯片整體封接在蓋玻片(尺寸 24 mm×50 mm)上，具體內(nèi)部結(jié)構(gòu)處于 PDMS 與蓋玻片之間：細(xì)菌細(xì)胞單層生長于較窄、較低的眾多生長通道內(nèi)，這些單細(xì)胞生長通道一端為封閉端，另一端開口與更寬、更高的培養(yǎng)基通道相接，培養(yǎng)基通道兩側(cè)開頭通過持續(xù)不斷的液體培養(yǎng)基流動，以及營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散作用，為單細(xì)胞生長通道內(nèi)的細(xì)胞提供源源不斷的營養(yǎng)成分。在營養(yǎng)充分的條件下，通道內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞隨著時間推移逐漸沿著生長通道分裂生長為一條線，多余細(xì)胞通過分裂生長自然伸出生長通道，被培養(yǎng)基通道內(nèi)的高速液體流動沖走。此時，處于生長通道封閉段的母細(xì)胞在微流控芯片內(nèi)的相對位置不變，其營養(yǎng)條件也是穩(wěn)定的，因而整個微流控芯片設(shè)計可被看作一種單細(xì)胞水平的微量培養(yǎng)恒化器。

圖1 母細(xì)胞芯片微流控芯片圖Fig. 1 Mother machine as microfludics

2.2.2 硅片模板

(1)單細(xì)胞生長通道的制作

a. 準(zhǔn)備 76.2 mm 的硅片，用低強(qiáng)度等離子處理 30 min。

b. 從冰箱中取出 SU-8 2002 光刻膠和 SU-8 2000.5 光刻膠，待光刻膠溫度與室溫一致時，按V(SU-8 2002)∶V(SU-8 2000.5)＝8∶2(體積比)將兩種膠在離心管中混勻。

c. 設(shè)定勻膠機(jī)程序：預(yù)甩 600 r/min，9 s；勻膠 4 000 r/min，30 s。

d. 將表面潔凈的硅片置于勻膠機(jī)吸盤上，在硅片上添加室溫混合膠 2 mL，運(yùn)行程序。

e. 將硅片置于平整的熱板上 95 ℃ 烘 2 min。

f. 在曝光機(jī)的吸盤周圍套入橡膠圈，將第一層鉻板掩膜清潔干凈后放在臺架上(鍍鉻面向下)，并開啟真空，將一塊較大的錫箔紙蓋在掩膜上。

g. 將硅片放在吸盤上，待冷卻后推入(記錄此時硅片的位置，確保在后續(xù)可以對準(zhǔn)結(jié)構(gòu))。

h. 上升吸盤，用錫箔紙遮蓋，執(zhí)行真空曝光，觀察真空表讀數(shù)——如果漏氣，則復(fù)位吸盤后再次上升，確保橡膠圈與掩膜貼合良好不漏氣。

i. 曝光量為 70 mJ/cm2，需要根據(jù)曝光機(jī)的功率調(diào)整曝光時間。其中，預(yù)設(shè)曝光時間應(yīng)長于真實(shí)曝光時間(如需曝光 4 s，則設(shè)置 30 s 曝光時間)。啟動曝光時先用錫箔紙遮擋，當(dāng)剩余時間等于需曝光時間時，快速撤下錫箔紙，結(jié)束曝光。

j. 曝光后于 95 ℃ 烘 1 min，取下硅片，冷卻。

k. 用丙二醇甲醚醋酸酯(PM)顯影液顯影；隨后用異丙醇沖洗殘留顯影液，接著用氮?dú)獯蹈杀砻?，于體視顯微鏡下觀察顯影效果。

l. 若顯影后結(jié)構(gòu)清晰，則用烘箱 180 ℃ 堅(jiān)膜1 h，否則重復(fù)上一步。m. 冷卻后取出，用臺階儀測量子通道高度并記錄。

(2)培養(yǎng)基通道的制作

整體實(shí)驗(yàn)流程與上部分單細(xì)胞生長通道的制作相同，但需要修改一些具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)：使用SU-8 3025 光刻膠，離心 3 000 r/min，前烘30 min，需要進(jìn)行校準(zhǔn)使其與第一層對齊，曝光量為 150 mJ/cm2，后烘 5 min。

2.2.3 PDMS 芯片制作

(1)固定硅片模板

a. 將硅片模板用透明膠貼在玻璃板中間(勿貼到結(jié)構(gòu))，同時在玻璃板四周豎著貼上錫箔膠帶密封，防止倒入 PDMS 單體后在熱固化時泄漏；

b. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質(zhì)量比混合，攪拌(5 min)均勻，然后抽真空 15 min，再用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

c. 將上一步無氣泡 PDMS 與引發(fā)劑的混合液體，適量倒入第(a)步制作好的貼有硅片模板的玻璃板容器內(nèi)，放入烘箱內(nèi)的水平臺上，80 ℃、烘 30 min 以上。

也可以直接用無塵膠帶將模板貼到玻璃板容器中間后，直接倒入 PDMS 和引發(fā)劑進(jìn)行 PDMS芯片固化。

(2)PDMS 芯片固化

a. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質(zhì)量比混合，攪拌(5 min)均勻后抽真空(10 min)，最后用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

b. 根據(jù)硅片模板表面積及所需微流控芯片厚度計算 PDMS 和引發(fā)劑混合液體用量(這里芯片厚度約為 5 mm，PDMS 和引發(fā)劑混合液體需22 g 左右)，倒在硅片模板上，整體放入烘箱，80 ℃ 烘 1 h 以上。

(3)PDMS 芯片切割

使用手術(shù)刀將固化好的芯片從硅片模板上切下，注意不要太靠近芯片結(jié)構(gòu)，刀落到硅片上，切到底可見空氣進(jìn)入的痕跡，然后將芯片放在LED 燈上進(jìn)一步切割。

(4)PDMS 芯片打孔

將 PDMS 芯片放在 LED 燈上操作，選擇合適孔徑(這里為 0.8 μm)的打孔器從結(jié)構(gòu)面向下打，拔出時要小心緩慢，可雙向旋轉(zhuǎn)拔出，注意不要裂口，然后用氮?dú)鈿饬髑謇泶蚝玫目?注意打孔器的針頭最好頻繁更換，以避免打孔時產(chǎn)生過多的 PDMS 碎屑對單細(xì)胞培養(yǎng)時產(chǎn)生堵塞通道，可在正式打孔前測試一下)。

(5)PDMS 芯片與蓋玻片封接

a. 先用異丙醇清洗蓋玻片，然后氮?dú)獯党惐家后w；b. 用無塵膠帶粘去 PDMS 芯片結(jié)構(gòu)面灰塵及碎屑；

c. 將蓋玻片和 PDMS 芯片結(jié)構(gòu)面向上放置，一起進(jìn)行等離子清洗——HI 檔(18 W，氣壓266 Pa，氣流 25 mL/h)，2 min(等離子處理時間可調(diào)整，一般不要超過 2 min)；

d. PDMS 芯片依靠重力貼在玻璃板上(多塊芯片考慮排布以合理利用空間)，若貼合過程迅速則表明等離子處理后 PDMS 芯片和蓋玻片表面性質(zhì)良好；

e. 貼合后的芯片放入烘箱 80 ℃ 烘 10 min。

(6)通道修飾及鏡檢

a. 將已過濾除菌的 1% F-127 水溶液，通過培養(yǎng)基通道入口緩慢注入芯片(戴護(hù)目鏡)，修飾至少 30 min；

b. 10 倍鏡或 20 倍鏡下檢查芯片通道(是否完好)、打孔及封接情況，無誤后放入?yún)捬豕ぷ髡尽?.2.4 單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)菌培養(yǎng)與預(yù)處理

在厭氧箱內(nèi)進(jìn)行平板劃線，挑選 5 個單菌落于 3 mL 液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行活化過夜，過夜培養(yǎng)所得的菌液與培養(yǎng)基按 1∶100 轉(zhuǎn)接至 120 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)后期。用封膜封住離心管口后，將菌液以 5 000 r/min 離心 10 min。倒出上清液，重懸沉淀再次離心，以 5 000 r/min 離心5 min。使用含 0.01 g/mL F-127 的上清液重懸菌體，渦旋混勻。其中，固體培養(yǎng)基為 LB 瓊脂(E. coli)和 BHI 瓊脂(B. fragilis)，液體培養(yǎng)基為RDM+glucose (E. coli)和 BHIS (B. fragilis)。

(2)細(xì)菌裝載

將混勻的濃縮菌液注入芯片，采用無塵膠帶貼上芯片出入口，將芯片固定在培養(yǎng)皿內(nèi)，封膜，以 2 000～2 500 r/min 離心 5 min。在厭氧工作站內(nèi)將芯片固定于自制厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)，密封好后架設(shè)到顯微鏡上，連接氣路和液路。

(3)單細(xì)胞延時拍攝

待厭氧盒內(nèi)氧氣指示劑保持粉色，使用 100×油鏡觀察熒光場——若無可見熒光激發(fā)(E. coli)，則開始選點(diǎn)進(jìn)行延時拍攝。實(shí)驗(yàn)完成后，使用自主研發(fā)的相關(guān)軟件進(jìn)行圖像處理與數(shù)據(jù)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 厭氧程度評估

本實(shí)驗(yàn)體系的關(guān)鍵點(diǎn)在于單細(xì)胞培養(yǎng)時厭氧條件的維持，這里從培養(yǎng)氣體氛圍與細(xì)胞學(xué)水平證據(jù)(熒光蛋白激發(fā))來進(jìn)行評估。

3.1.1 氣體氛圍

厭氧培養(yǎng)盒在實(shí)驗(yàn)中會持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚狻?5% N2＋5% CO2，以營造并長期維持盒內(nèi)厭氧環(huán)境。其中，N2為模擬空氣主要成分，生理意義不大，一定濃度的 CO2為細(xì)菌正常生長所必需[15]。該氣體組成與常用的厭氧工作站基本相同，只是缺少 H2，而 H2在厭氧工作站的主要作用是便于在催化裝置的作用下與 O2反應(yīng)生成H2O 以達(dá)到除氧的目的，但由于厭氧培養(yǎng)盒并不像厭氧工作站一樣體積巨大，需要時常取放實(shí)驗(yàn)物品或者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作而出現(xiàn) O2進(jìn)入的風(fēng)險；反之，厭氧培養(yǎng)盒具有優(yōu)秀的氣密性，并且在整個厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中一直維持密封，整體組裝也在厭氧工作站內(nèi)進(jìn)行，故無需除氧。

實(shí)驗(yàn)中，厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)放置有氧氣指示劑，當(dāng)盒內(nèi)氣體氛圍達(dá)到厭氧狀態(tài)時，氧氣指示劑會維持粉色(圖 2)，表明此時厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)氣體中O2濃度低于檢測下限(≤0.1%)。這種狀態(tài)會在厭氧盒密封并持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚鈺r長期維持，只有在實(shí)驗(yàn)中切換所通入的氣體，將厭氧混合氣換成壓縮空氣時，指示劑才會較快地變?yōu)樗{(lán)紫色(超過檢測上限 0.5%)，表明厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)氣體中的氧氣濃度迅速提升至與空氣相同。

圖2 培養(yǎng) 48 h 后厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)氧氣指示劑Fig. 2 Oxygen indicator in anaerobic box after 48 h

3.1.2 細(xì)胞水平

在細(xì)胞學(xué)水平，本實(shí)驗(yàn)采用熒光蛋白作為嚴(yán)格厭氧指示劑。熒光蛋白基因位于細(xì)菌染色體上，屬于組成型表達(dá)基因，這意味著熒光蛋白在穩(wěn)態(tài)生長的細(xì)菌細(xì)胞中始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)[16]。而作為常規(guī)的熒光蛋白，其成熟發(fā)光除了特定光激發(fā)之外，還有一個基礎(chǔ)條件就是氧氣的存在[17]，除非是特定改造專門適用于厭氧環(huán)境激發(fā)的熒光蛋白[18]。

如圖 3(d)所示，在有氧培養(yǎng)下，微流控芯片中細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的熒光蛋白受激發(fā)產(chǎn)生明顯的熒光；而在厭氧培養(yǎng)下，雖然對明場延時拍攝圖片的分析表明細(xì)菌細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定(圖 4(b)，左半部分)，但是細(xì)胞中的熒光蛋白在相應(yīng)波長激發(fā)光激發(fā)下，并無明顯的可見熒光產(chǎn)生(圖 3(b)，LUTs 打開增強(qiáng)敏感度，故視野并非黑白)，說明此時細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度不足以保證熒光蛋白成熟而受激發(fā)光。Hansen 等[17]研究表明，1×10－7濃度的溶解氧足以使熒光蛋白受激發(fā)產(chǎn)生熒光，而2.5×10－8濃度的溶解氧則不足以支持熒光蛋白受激發(fā)而發(fā)光。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在厭氧培養(yǎng)盒持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚膺M(jìn)行厭氧培養(yǎng)時，微流控芯片內(nèi)溶解氧濃度至少低于 1×10－7，達(dá)到了優(yōu)秀的嚴(yán)格厭氧程度，完全滿足兼性厭氧菌與嚴(yán)格厭氧菌的厭氧培養(yǎng)，實(shí)際上 0.1% 的氧氣組成已不會對一些嚴(yán)格厭氧菌的正常生長產(chǎn)生影響[12]。

圖3 大腸桿菌厭氧及有氧條件下明場相差及對應(yīng)熒光場圖像(LUTs 打開)Fig. 3 E. coli under bright field and corresponding fluorescence photos under anaerobic and aerobic conditions (LUTs ON)

3.2 細(xì)菌單細(xì)胞穩(wěn)定生長

在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完成后，采用自主研發(fā)的分析程序進(jìn)行圖像分析與數(shù)據(jù)處理。通過對大量單細(xì)胞的生長速率進(jìn)行分析可知(圖 4)：對于嚴(yán)格厭氧菌(B. fragilis)，此實(shí)驗(yàn)方法可以保證其長期穩(wěn)定地進(jìn)行生長與分裂；對于兼性厭氧菌 (E. coli)，此實(shí)驗(yàn)方法既可以提供厭氧環(huán)境確保厭氧穩(wěn)定生長，又可以將通入的厭氧混合氣改為空氣使其實(shí)現(xiàn)常氧生長。

圖4 芯片內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞在嚴(yán)格厭氧條件下穩(wěn)定生長與分裂Fig. 4 The robust growth and division of bacterial cells in microfluidic chips under strictly anaerobic condition

4 結(jié)果與討論

當(dāng)下對細(xì)菌生理學(xué)的研究越來越關(guān)注單細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性[8]，如細(xì)菌群體中基因回路的動態(tài)表達(dá)[19]、細(xì)胞生理狀態(tài)對抗生素的敏感性[20]、對細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生過程中起重要作用的持留性細(xì)胞[21]等。除了方興未艾的微生物單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組研究外[22-23]，往往僅采用傳統(tǒng)的群體分批培養(yǎng)方法，而這在研究的時空“分辨率”上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。基于微流控芯片的單細(xì)胞技術(shù)為研究細(xì)胞異質(zhì)性提供了可能，這些方法中比較重要的一大類就是基于高分辨率顯微鏡的延時拍攝技術(shù)。對于在常氧條件下進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，已經(jīng)有許多相關(guān)培養(yǎng)方法，包括基于瓊脂糖平板培養(yǎng)[24]、基于微流控芯片培養(yǎng)等[25-26]，其中后者能夠在保證穩(wěn)定生長分裂前提下，實(shí)現(xiàn)上百代細(xì)菌的單細(xì)胞譜系追蹤，但對于厭氧條件下的單細(xì)菌長期培養(yǎng)的研究甚少。

厭氧菌在自然界廣泛存在，而且人體腸道本就是一種厭氧環(huán)境?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為腸道微生物對人類的健康具有很大的影響[27-28]，如瘧疾[29]、肥胖[30]、糖尿病[31]、癌癥的免疫應(yīng)答[32]、神經(jīng)(腦腸軸)[33]等，甚至有望基于腸道微生物進(jìn)行個性化醫(yī)療[34]?；诖?，在進(jìn)行單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時，需要考慮到厭氧這一條件對細(xì)菌細(xì)胞生理的影響。針對以上需求，需要開發(fā)一種對培養(yǎng)環(huán)境氧氣氛圍有著嚴(yán)格控制的實(shí)驗(yàn)裝置。無論是瓊脂糖平板培養(yǎng)還是微流控芯片培養(yǎng)，在不需要控制氧氣組成比例的前提下，所需實(shí)驗(yàn)空間都不大，可以便捷地與商業(yè)化顯微鏡標(biāo)本夾相結(jié)合使用。但是，目前商業(yè)顯微鏡移動平臺與細(xì)胞培養(yǎng)裝置并不能營造厭氧環(huán)境，因?yàn)檫@需要額外提供具有優(yōu)秀氣密性的培養(yǎng)裝置。這種裝置需能夠同時容納單細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境與液體培養(yǎng)基，在裝置外還需要相應(yīng)的氣體調(diào)節(jié)與維持系統(tǒng)，最后為了方便實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時采集、提高數(shù)據(jù)可信度、降低實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性、提高方法通用性，往往需要在設(shè)計時就考慮到培養(yǎng)裝置與顯微成像系統(tǒng)的合理適配。

目前涉及到厭氧條件的細(xì)菌單細(xì)胞方法的相關(guān)報道并不多，尤其是能夠直接與顯微延時拍攝相結(jié)合的方法只有基于原有設(shè)計[35]——在瓊脂糖平板外添加密封裝置并通入?yún)捬趸旌蠚?，以此?shí)現(xiàn)對一種厭氧的脫硫弧菌(Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough)的培養(yǎng)。此外，借此研究了可逆的低濃度氧氣暴露對細(xì)胞分裂的影響[36]。此方法由于是固體平板培養(yǎng)，存在營養(yǎng)消耗的影響，難以完美地保持穩(wěn)定生長，而且所采集的數(shù)據(jù)量較少、難以追蹤單細(xì)胞譜系。雖如文中所述，培養(yǎng)時細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白無法受激發(fā)發(fā)出熒光，以此論證其實(shí)驗(yàn)裝置的厭氧程度，但是針對“無熒光”這一關(guān)鍵要素并未提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。而實(shí)際上有研究表明，培養(yǎng)氣體氛圍中 0.1% 的氧氣就足以滿足熒光蛋白受激發(fā)光所需[12]，在此氧氣濃度下即便是嚴(yán)格厭氧菌，由于其對氧氣有一定的耐受性，也可正常生長[12,37]，故僅有嚴(yán)格厭氧菌生長的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能說明其實(shí)驗(yàn)裝置厭氧程度很高。

5 結(jié) 論

本文所描述的細(xì)菌單細(xì)胞實(shí)時觀測系統(tǒng)主要創(chuàng)新之處在于使用了一種自主設(shè)計的厭氧培養(yǎng)裝置。它是由 3D 打印和數(shù)控機(jī)床加工而來，內(nèi)部承載微流控芯片和液體培養(yǎng)基，進(jìn)行組裝密封后，具有優(yōu)異的氣密性：氧氣指示劑達(dá)到測量下限(0.1%)，而細(xì)菌內(nèi)熒光蛋白受激發(fā)無明顯可見亮光，進(jìn)一步證明細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解氧濃度低于1×10－7。該裝置可以適配商業(yè)化顯微鏡的適配器，又與氣體調(diào)節(jié)系統(tǒng)相連，后者為裝置內(nèi)部持續(xù)通入?yún)捬鯕怏w，在負(fù)壓的驅(qū)動下，新鮮液體培養(yǎng)基持續(xù)不斷地為細(xì)菌細(xì)胞提供營養(yǎng)，最終能夠確保芯片內(nèi)所培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞在長期穩(wěn)定的嚴(yán)格厭氧環(huán)境下進(jìn)行生長與分裂(前提是細(xì)菌本身能夠在厭氧環(huán)境下生長)。本文所開發(fā)的實(shí)驗(yàn)裝置及相應(yīng)的整套實(shí)驗(yàn)流程為嚴(yán)格厭氧條件下的細(xì)菌生理學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。同時，由于整個實(shí)驗(yàn)裝置出色的氣密性，除了嚴(yán)格厭氧微生物培養(yǎng)，還可以定量化探究不同氣體組成對特定微生物生長的影響。但本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)目前只能使用單一培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)，尚不能滿足一些需要切換培養(yǎng)基的特殊實(shí)驗(yàn)需求，希望未來的研究能對此進(jìn)行優(yōu)化。