基因工程納米顆粒在 EB 病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用概述

黃建東 黃 琨

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院 深圳 518055)

1 引 言

EB 病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是人類至今未攻克的一大科學(xué)難題。該病毒在人群中感染非常廣泛，流行病學(xué)研究表明全球約有 90% 的成年人存在 EB 病毒感染[1]。大多數(shù)初次感染發(fā)生在幼兒時(shí)期且無臨床癥狀，而青少年時(shí)期的感染往往會(huì)引發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥。此外，成年人感染 EB 病毒可誘發(fā)多種疾病甚至癌癥，全球每年新增癌癥病例中就有約 20 萬病例與 EB 病毒感染直接相關(guān)[2]，因此 EB 病毒被世界衛(wèi)生組織歸為第一類致癌病毒。與 EB 病毒感染高度相關(guān)的癌癥包括鼻咽癌、胃癌、霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤等。其中，鼻咽癌與 EB 病毒相關(guān)性最高，并且高發(fā)于我國(guó)廣東、香港等南方地區(qū)，被列為我國(guó)重點(diǎn)防治的十大惡性腫瘤之一。目前，全球還沒有可接種的EB 病毒防治疫苗。而在我國(guó)，針對(duì)高發(fā)的 EB 病毒陽性鼻咽癌，主要手段為放射性療法同多種化療藥聯(lián)合治療，而針對(duì)晚期鼻咽癌患者的治療手段則更為有限。因此，開發(fā)防治 EB 病毒感染所誘發(fā)相關(guān)疾病的變革性疫苗刻不容緩。隨著合成生物學(xué)、基因工程技術(shù)的進(jìn)步，各種工程化合成疫苗載體得以迅速發(fā)展，并在 EB 病毒預(yù)防及相關(guān)腫瘤綜合治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。

2 EB 病毒

EB 病毒主要通過唾液在鼻咽部及扁桃體傳播感染，在鼻咽上皮細(xì)胞以及隨上皮組織中的血管到達(dá) B 淋巴細(xì)胞中增殖復(fù)制或進(jìn)入潛伏期。EB 病毒基因組主要以附加體形式(Episomes)游離于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核并編碼約 100 個(gè)基因[3]。EB 病毒存在多種變異株，因此引發(fā)的相關(guān)疾病具有非常明顯的地域差異。例如，伯基特淋巴瘤高發(fā)于中非地區(qū)，霍奇金淋巴瘤高發(fā)于歐美國(guó)家，鼻咽癌高發(fā)于我國(guó)南方地區(qū)。通過大量比對(duì)華南高發(fā)區(qū)與歐美地區(qū)及其他低發(fā)區(qū)鼻咽癌樣本中 EB 病毒的全基因組捕獲測(cè)序，分析鼻咽癌發(fā)生與相應(yīng) EB 病毒基因組的關(guān)系，證實(shí)廣東地區(qū)約 83% 的鼻咽癌患者感染的 EB 病毒高危亞型為BALF2基因非同義變異位點(diǎn) BALF2_CCT，而并非普遍感染中國(guó)人群的 LMP1-China1 亞株[4]，該亞型在歐洲和非洲等地則極為罕見。同時(shí)，人群中不同的人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)等位基因型易感 EB 病毒的程度也有所不同。通過大量比對(duì)華南地區(qū)鼻咽癌患者中的 HLA 等位基因型發(fā)現(xiàn)，患者體突變形成的HLA-A*02:07 與 HLA-B*58 等位基因是 EB 病毒的易感受體，與鼻咽癌的低生存率也高度相關(guān)[5]。

由于 EB 病毒的主要宿主細(xì)胞是人類 B 細(xì)胞，感染后的 B 細(xì)胞很難正確執(zhí)行外來病毒抗原呈遞的作用，從而導(dǎo)致機(jī)體很難通過體液免疫及經(jīng)由 B 細(xì)胞抗原提呈的下游細(xì)胞免疫來對(duì)抗病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染。有研究通過對(duì)鼻咽癌病人腫瘤組織的單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)[6-7]，CD8＋T 細(xì)胞在浸潤(rùn) EB 病毒陽性的鼻咽癌組織后很快轉(zhuǎn)變?yōu)楹慕郀顟B(tài)，或以一個(gè)“旁觀者”的姿態(tài)，不發(fā)揮任何腫瘤殺傷功能，這種現(xiàn)象是 B 細(xì)胞功能失調(diào)的良好佐證。同時(shí) EB 病毒的感染可潛伏于記憶 B 細(xì)胞中，這種潛伏期由于不表達(dá)任何病毒來源的蛋白，被稱為潛伏 0 期。該潛伏現(xiàn)象使得這類被感染的細(xì)胞很難被免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)并清除。綜上不難看出，由于 EB 病毒突變株的地域差異、人群易感表型不同以及攻擊人類 B 細(xì)胞等特性，EB 病毒防治疫苗的研發(fā)十分困難。

目前，研發(fā)階段的 EB 病毒疫苗主要以病毒的外膜糖蛋白 gp350 作為抗原靶點(diǎn)，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體以阻止病毒與 B 細(xì)胞表面受體結(jié)合。前期臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該靶點(diǎn)的生物活性及安全性，但對(duì)無癥狀或特定的感染者不能有效預(yù)防，使得該疫苗的適用范圍大大縮小?；谔堑鞍譯B、gH、gL、gp42 為復(fù)合靶點(diǎn)的疫苗也可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，阻止病毒感染，但也面臨由于刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的滴度較低，不能有效阻斷病毒感染的臨床問題[8]。另外，關(guān)于 EB病毒潛伏期蛋白，各項(xiàng)研究均表明，EBNA1、EBNA3 所能引起的 CD4＋T 細(xì)胞及 CD8＋T 細(xì)胞免疫應(yīng)答效果并不理想[9]；LMP1 幾乎不能引起 CD4＋細(xì)胞或 CD8＋T 細(xì)胞的特異性應(yīng)答，反而是通過使腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)表達(dá)量增加來引起 T 細(xì)胞對(duì) TAA的響應(yīng)[10]。因此，尋求更全面的免疫原覆蓋替代單一病毒靶蛋白形式，最大化阻斷 EB 病毒感染、提升病毒抗原的主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)分子親和力及呈遞效率，從而提高對(duì) T 細(xì)胞的活化效果并殺傷感染細(xì)胞，是未來 EB 病毒疫苗研發(fā)的重點(diǎn)發(fā)展方向。本文作者團(tuán)隊(duì)利用反向疫苗學(xué)理念，以新冠(SARS-CoV-2)病人血液中病毒基因組捕獲為平臺(tái)，對(duì)新冠病毒刺突蛋白 Spike 的抗原表位進(jìn)行了篩選，再對(duì)篩選出的相關(guān)抗原進(jìn)行高通量克隆、表達(dá)和純化，進(jìn)行血清學(xué)及小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)，篩選出多個(gè)具有保護(hù)性的新冠病毒抗原[11]，并用潛在的 Spike 受體結(jié)合域(Receptor Binding Domain，RBD)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)疫苗并免疫倉鼠，驗(yàn)證了候選抗原的體內(nèi)反應(yīng)效果[12]。因此，基于反向疫苗學(xué)抗原篩選平臺(tái)，可尋求 EB 病毒更多潛在的高免疫原性的靶點(diǎn)，再設(shè)計(jì)能輔助免疫原性增強(qiáng)、將多種病毒蛋白以不同形式整合并完整呈現(xiàn)的疫苗平臺(tái)，是 EB 病毒疫苗研發(fā)的突破口。新型基因工程納米顆粒疫苗載體的構(gòu)建為EB 病毒疫苗研究注入新的活力。本文將總結(jié)近年來針對(duì) EB 病毒采用納米顆粒形式防治疫苗的研究進(jìn)展，為新一代 EB 病毒疫苗的研發(fā)提供更多研究基礎(chǔ)、設(shè)計(jì)思路及新方向。

3 工程化外泌體納米顆粒

外泌體是一種直徑為40～160 nm的納米囊泡顆粒[13]，外泌體的脂雙層膜結(jié)構(gòu)不僅能攜帶多種生物活性蛋白，還能包裹多種核酸分子，包括 mRNA、小 RNA(miRNA)、長(zhǎng)非編碼 RNA(lncRNA)、DNA 等。外泌體經(jīng)靜脈注射，30 min 后可快速在肝臟、脾臟、肺、腎等器官富集，并可通過血腦屏障等多種生物屏障；通過其表面承載的 CD55 及 CD59 分子，可以有效防止外泌體在外周血液循環(huán)時(shí)被降解，增強(qiáng)了外泌體的穩(wěn)定性及半衰期[14]。外泌體可通過多種途徑被附近受體細(xì)胞或者經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)被遠(yuǎn)端細(xì)胞有效吸收，從而獲取其承載的生物信息分子或者靶向藥物，包括網(wǎng)格蛋白依賴性胞吞作用(Clathrin-Dependent Endocytosis)、陷穴蛋白依賴性胞吞作用(Caveolin-Dependent Endocytosis)、吞噬作用(Phagocytosis)、巨胞飲作用(Macropinocytosis)、脂筏介導(dǎo)性內(nèi)吞(Lipid Raft-Mediated Uptake)、細(xì)胞膜直接融合以及受體介導(dǎo)性內(nèi)吞[15]。同時(shí)，不同細(xì)胞來源的外泌體表面可攜帶不同的功能分子，如 MHC 分子、共刺激分子等，能夠激活體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞(B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和抗原特異性 T 細(xì)胞等)的免疫反應(yīng)。因此，通過對(duì)外泌體來源細(xì)胞的基因工程改造，能形成含有多種目的分子的外泌體并用于激活 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而特異性殺傷病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等。綜上所述，外泌體具有良好的生物體兼容性、較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期、便于基因工程改造包裝、生物安全性以及便于大規(guī)模工程化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使其成為一種新型、備受矚目的癌癥免疫治療平臺(tái)遞送工具。

目前，已有許多研究利用外泌體成功遞送核酸、蛋白、抗體、納米抗體、復(fù)合物及化療藥物等。通過工程質(zhì)粒、病毒載體攜帶不同目標(biāo)蛋白、抗體或 miRNA 等轉(zhuǎn)染改造外泌體來源細(xì)胞，或?qū)⑿》肿铀幬锶绨⒚顾?Doxorubicin 電轉(zhuǎn)染進(jìn)來源細(xì)胞使其分泌的外泌體中包裝有該類藥物[16]。還可通過展示相應(yīng)的受體配體，增加外泌體的細(xì)胞特異靶向性：如 DC 細(xì)胞來源的外泌體攜帶 ICAM-1 可以有效并特異靶向 T 細(xì)胞上的LFA-1[17]， EB 病毒糖蛋白 gp350 可特異靶向 B細(xì)胞 CD21 受體等。工程化的 SMART-Exo 外泌體表面展示 CD3 抗體分子、EGFR 抗體及 HER2抗體，幫助 T 細(xì)胞激活并重新定向于表達(dá) EGFR/HER-2 的乳腺癌細(xì)胞[18]。工程化的 B7-Exo 攜帶白血病相關(guān)抗原及 B7 共刺激分子 CD80/CD86，可對(duì)荷瘤小鼠(白血病細(xì)胞系 L1210)起到有效的保護(hù)作用[19]。采用腫瘤特異性多肽脈沖樹突狀細(xì)胞，可獲得表面攜帶抗原多肽的 MHC 外泌體MHC-Exo，并在多項(xiàng)腫瘤治療臨床前實(shí)驗(yàn)中取得良好的效果[20-22]。工程化 Lewis 肺癌細(xì)胞(3LL)產(chǎn)生的外泌體攜帶 CD40 配體 CD154(CD40L)，該外泌體 CD40L-Exo 可有效促進(jìn) DC 分化，誘導(dǎo)Th 1 分泌細(xì)胞毒性因子，減輕小鼠荷瘤負(fù)擔(dān)[23]。采用腫瘤細(xì)胞自體產(chǎn)生的外泌體(Tumor-Derived Exosomes，TEX)，并修飾有 Toll 樣受體 4(Toll-Like Receptor 4，TLR4)通路傳遞信號(hào)-警報(bào)素家族成員 HMGN1 的氮端功能域 N1ND，工程化為TEX-N1ND 外泌體刺激 DC，發(fā)現(xiàn)對(duì) DC 激活有促進(jìn)作用，并增強(qiáng)了 T 細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞 HCC 的潛在殺傷效果[24]。工程化生物素修飾后的外泌體可耦合鏈霉親和素連接的 IFNγ 形成 IFNγ-Exo 外泌體，促進(jìn) M1 巨噬細(xì)胞極化、增加 IFNγ＋/CD8＋T 細(xì)胞并拮抗調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Treg)，共表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)可有效控制前列腺癌細(xì)胞 RM-1增殖[25]。外泌體表面展示 TNFα 受體 TNFR1，TNFα-Exo 外泌體可捕獲 TNFα，阻斷由 TNFα 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[26]。同時(shí)，在新冠疫苗研發(fā)方面，深圳市第二人民醫(yī)院的段莉等[27]也基于外泌體平臺(tái)制備開發(fā)了新冠病毒疫苗。圖 1 中總結(jié)了目前在研的用于臨床治療的工程化外泌體納米顆粒[28]。

圖1 基因工程化外泌體在臨床免疫治療中的應(yīng)用[28]Fig. 1 Engineered exosomes for cancer immunotherapy[28]

EB 病毒作為誘發(fā)多種癌癥的病毒，其表達(dá)蛋白可作為腫瘤新抗原，并工程化修飾于外泌體表面，經(jīng)嵌合修飾后的工程化外泌體有望被用于 EB 病毒相關(guān)疾病的臨床免疫治療。Du 等[29]發(fā)現(xiàn)，通過在外泌體中儲(chǔ)存 miR-200a 及 miR-200b，可調(diào)控其下游的 E-cadherin 表達(dá)，從而抑制 EB 病毒陽性胃癌的發(fā)生。Hurwitz 等[30]發(fā)現(xiàn)，CD63 富含于循環(huán)外泌體中，參與 EB 病毒潛伏期蛋白 LMP1 的外泌體包裝循環(huán)，當(dāng)敲除外泌體中的 CD63 分子時(shí)可有效抑制 LMP1 引起的 mTOR 信號(hào)激活，從而抑制 EB 病毒相關(guān)癌癥的發(fā)生。Wang 等[31]發(fā)現(xiàn)，用帕米膦酸鹽(Pamidronate，PAM)體外刺激 Vδ2-T 細(xì)胞激活及擴(kuò)增，這種 T 細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中富含細(xì)胞程序死亡受體 FasL 及 TRAIL、NK 細(xì)胞激活受體 NKG2D、抗原呈遞分子 MHC I 及 MHC II、共刺激分子 CD80 及 CD86 等，能激活 EB 病毒陽性胃癌細(xì)胞 SNU-719 的細(xì)胞凋亡通路，抑制EB 病毒陽性 B 細(xì)胞瘤 LCL 的生長(zhǎng)，并能顯著提升荷瘤小鼠的生存率及生存時(shí)間。由于 Vδ2-T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)更偏向于天然免疫，不受限于受體 MHC 分子，因此比只能采用自體免疫細(xì)胞的細(xì)胞療法更具臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)。他們?cè)诜謩e給荷瘤小鼠注射 NK 細(xì)胞外泌體及 Vδ2-T 細(xì)胞外泌體后發(fā)現(xiàn)，Vδ2-T 細(xì)胞外泌體具有比 NK外泌體更加有效的腫瘤抑制效果。EB 病毒糖蛋白 gp350 與 B 細(xì)胞表面受體 CD21 結(jié)合，介導(dǎo)EB 病毒感染 B 細(xì)胞，感染后的 B 細(xì)胞分泌的外泌體中整合了糖蛋白 gp350，可轉(zhuǎn)移至未感染的 B 細(xì)胞，并激活 CD4＋T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗病毒免疫反應(yīng)。B 細(xì)胞來源的慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia of B-Cell Origin，B-CLL)是常見于西方國(guó)家成人中的一種 EB 病毒陽性白血病，這類 B 細(xì)胞腫瘤由于缺乏輔助分子及共刺激分子 CD40，無法通過激活 CD40 配體 CD154(CD40L)有效向T 細(xì)胞呈遞腫瘤相關(guān)抗原，從而導(dǎo)致腫瘤逃脫免疫監(jiān)視。Ruiss 等[32]采用表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的方式使 HEK293 細(xì)胞分泌含有 CD154 及 gp350 的外泌體，發(fā)現(xiàn)純化后的 CD154＋/gp350＋外泌體可高效地與 B-CLL 病人的 B 細(xì)胞結(jié)合，并有效地將CD154 信號(hào)傳遞給病人的 B 細(xì)胞，使其重新有效地執(zhí)行抗原呈遞，從而激活 CD4＋/CD8＋T 細(xì)胞gp350 的特異性免疫應(yīng)答，并執(zhí)行殺傷 B-CLL腫瘤細(xì)胞。

綜上，外泌體納米顆粒在臨床轉(zhuǎn)化中頗具優(yōu)勢(shì)，在對(duì)抗 EB 病毒方面也取得了一定進(jìn)展，但目前工程化的外泌體在適應(yīng)臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用前，還存在諸多需要解決以及改進(jìn)的問題。例如：如何運(yùn)用新基因工程技術(shù)(如 CRISPR 基因敲除技術(shù))去除外泌體中所有副效蛋白或 RNA 分子；如何改進(jìn)外泌體功能使其具有更好的安全性；如何選擇 EB 病毒有效抗原并利用外泌體嵌合更全面多樣的抗原等。

4 類病毒顆粒

傳統(tǒng)疫苗的制備周期較長(zhǎng)、免疫效果不佳，不適用于臨床大規(guī)模生產(chǎn)。近年來不斷興起的病毒樣顆粒(Virus-Like Particle，VLP)載體有望成為傳統(tǒng)疫苗形式的替代。VLP 是由病毒單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)顆粒，直徑為 20～150 nm，因其保持了病毒抗原蛋白的天然構(gòu)象，具備激發(fā)宿主先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的功能。由于缺乏病毒調(diào)節(jié)蛋白和感染性核酸，VLP 無復(fù)制和感染宿主的能力，所以其具有良好的生物安全性。VLP 作為一種新型的基因工程疫苗載體，具有強(qiáng)大的免疫優(yōu)勢(shì)，如表面結(jié)構(gòu)規(guī)則、大小合適、不含核酸、不能自主復(fù)制、不具有傳染性、易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生很好的免疫效果、半衰期較長(zhǎng)、質(zhì)量穩(wěn)定和安全可靠等。

類病毒顆粒大致可分為無包膜結(jié)構(gòu)的 VLP以及有包膜結(jié)構(gòu)的 VLP(VLP/LP)。若想在沒有脂雙層修飾的 VLP 表面呈現(xiàn)特異抗原，則需要進(jìn)行基因工程化改造，使其病毒結(jié)構(gòu)蛋白在自組裝時(shí)表面攜帶外源性抗原或帶有可化學(xué)耦合抗原分子的連接分子，如 Sulfo-SMCC[33]或 Spycatcher。本文作者團(tuán)隊(duì)的前期工作成功將Spycatcher 展示于乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)自發(fā)形成的類病毒顆粒表面，并與 Spytag 靶抗原蛋白或相關(guān)抗原多肽偶聯(lián)，通過噴鼻免疫的方式，快速激活小鼠體內(nèi)的黏膜免疫。還可通過基因工程化方式優(yōu)化改造 HBc 的特定側(cè)鏈氨基酸引入人工二硫鍵六聚體結(jié)構(gòu)，形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的工程化類病毒納米顆粒 VLP-SS1[34]。包膜結(jié)構(gòu)的 VLP-VLP/LP 也可同樣采用基因工程化方式進(jìn)行改造，或利用宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，使用簡(jiǎn)單的共孵育方法將糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol，GPI)錨定蛋白吸附于 VLP/LP 表面，通過 GPI 錨定分子吸附呈遞多種目標(biāo)抗原或納米抗體等，形成多功能的納米顆粒疫苗[35]。

類病毒顆粒疫苗在癌癥治療及病毒防護(hù)中已有多項(xiàng)應(yīng)用。例如，HBc 自組裝病毒顆粒表面可承載多種癌癥相關(guān)抗原(如黑色素瘤抗原MAGE-1、MAGE-3 等)，臨床實(shí)驗(yàn)中用于治療黑色素瘤[36]。在 EB 病毒預(yù)防疫苗的研發(fā)方面，嵌合新城疫病毒類病毒顆粒(NDV-VLP)，工程化改造融合了 EB 病毒糖蛋白 gp350/220，在體內(nèi)產(chǎn)生了持久性較強(qiáng)的 EB 病毒特異性中和抗體[37]。這種工程化的 NDV-VLP 不僅能引起體液免疫，還可以通過包裹 EB 病毒的 mRNA 分子，在免疫細(xì)胞內(nèi)翻譯，再由 MHC I 分子途徑激起 EB 病毒特異性 CD8＋T 細(xì)胞反應(yīng)[38]。采用NDV-VLP 工程化裝載 gH/gL-EBNA1 及 gB-LMP2，兩種形式的 VLP 均能使體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的 EB 病毒中和性抗體[39]。Pavlova 等[40]成功采用 293T細(xì)胞表達(dá)并純化出 EB 病毒 BFLF1/BFRF1A 的突變基因，形成不含病毒 DNA 的 EBV-VLP，激起了特異性的 CD4＋T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。該團(tuán)隊(duì)在此 VLP 的基礎(chǔ)上，又改造整合了 EB 病毒潛伏期蛋白 EBNA1 的兩段功能域 RI+RII，形成VLP-EBNA1RI+RII，隨后又逐次引入了 gp350 以及可對(duì)人源化小鼠模型起到良好 EB 病毒保護(hù)效果的 gH/gL[41]，再加入被膜蛋白 BNRF1，最大化疫苗的體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)[42]，擴(kuò)大了疫苗的保護(hù)作用。同時(shí)，其他團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了 EBVVLP 疫苗對(duì)免疫力低下的腎移植病人有較好的保護(hù)作用[43]。圖 2 展示了不同類病毒顆粒載體結(jié)合EB 病毒抗原的疫苗結(jié)構(gòu)。

圖2 類病毒顆粒在 EB 病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用Fig. 2 EB virus vaccines candidates based on engineered VLPs

在設(shè)計(jì) VLP 時(shí)，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的選擇以及外源性抗原融合病毒結(jié)構(gòu)蛋白單體的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。由于 VLP 自身的潛在免疫原性引起受體的非特異性免疫，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)遮蓋掉 VLP 所承載的特異性抗原本身的免疫原性信息(CIES 效應(yīng))，致使疫苗設(shè)計(jì)失效[44]。再者，大部分 VLP 的設(shè)計(jì)均基于感染真核細(xì)胞病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，由于原核微生物工程菌株缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)，基因工程化的蛋白無法正確折疊，從而發(fā)生自組裝，形成穩(wěn)定的 VLP 結(jié)構(gòu)，因此很難采用大腸桿菌等工程化微生物大規(guī)模地生產(chǎn)并純化 VLP。為確保VLP 疫苗質(zhì)量，目前商業(yè)化的生產(chǎn)采用的是酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳細(xì)胞等真核表達(dá)體系，導(dǎo)致設(shè)計(jì)難度及生產(chǎn)成本大幅提高。針對(duì)這兩方面主要缺陷，今后還需要科研工作者在 VLP 疫苗平臺(tái)的改造、生產(chǎn)及研發(fā)上重點(diǎn)突破。

5 鐵蛋白自組裝納米顆粒

鐵蛋白(Ferritin)可自發(fā)組裝成由 24 個(gè)亞基構(gòu)成的球狀簇，球體直徑約為 12 nm，可以快速有效地穿越體內(nèi)屏障(血腦屏障、血睪屏障等)擴(kuò)散至全身各處淋巴結(jié)，是一種理想的蛋白疫苗納米遞送平臺(tái)。鐵蛋白自組裝納米顆粒具有較多的抗原容納區(qū)域，可以容納多種抗原多肽，并高效提呈給 DC 細(xì)胞。由于鐵蛋白自組裝納米顆粒有極高的熱穩(wěn)定及化學(xué)穩(wěn)定性，更加便于對(duì)其大規(guī)模工業(yè)化提純生產(chǎn)[45]。鐵蛋白的自身免疫原性很低，具有很好的抗原遞送屬性及生物安全性。Ma 等[46]在鐵蛋白納米顆粒表面引入 Spycatcher/Spytag 系統(tǒng)，使得載體更具備抗原組裝的靈活性，并采用該納米顆粒平臺(tái)同時(shí)將 24 個(gè)新冠病毒SARS-CoV-2 刺突蛋白 Spike 的受體結(jié)合域(RBD)和七肽重復(fù)域(HR)呈遞于納米顆粒表面。該疫苗在小鼠和恒河猴中均能夠顯著誘導(dǎo)出高滴度的中和抗體。目前，研究人員計(jì)劃對(duì)這些納米顆粒進(jìn)行臨床前安全評(píng)估，并力爭(zhēng)進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。

針對(duì) EB 病毒的疫苗設(shè)計(jì)，Kanekiyo 等[47]用 EB 病毒外膜糖蛋白 gp350 的突變片段 D123與鐵蛋白融合，成功自組裝形成 D123-鐵蛋白納米顆粒，并誘導(dǎo)出高滴度的 EB 病毒有效保護(hù)抗體。Bu 等[48]采用 EB 病毒外膜糖蛋白 gH/gL/gp42 的融合片段與鐵蛋白氮末端進(jìn)行基因融合，合成了 gH/gL/gp42 的鐵蛋白納米顆粒疫苗，產(chǎn)生的 EB 病毒特異性中和抗體對(duì) B 細(xì)胞病毒感染起到了很好的保護(hù)作用。

與類病毒顆粒相比，在鐵蛋白納米顆粒上呈現(xiàn)的抗原分子不密集，也不會(huì)被其他衣殼蛋白遮蔽，能讓免疫系統(tǒng)獲取更全面的特異性抗原信息，使得該類新型納米顆粒疫苗具有更大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

6 其他新型納米顆粒 EB 病毒疫苗

除了通過基因工程改造納米顆粒來源細(xì)胞的方法外，還有一些化學(xué)方法可有效形成工程化的納米顆粒遞送抗原表達(dá) mRNA，或多肽抗原分子及免疫佐劑等，并已用于研制 EB 病毒疫苗。例如，納米復(fù)合物 FNC 可同時(shí)遞送 EB 病毒潛伏期抗原 EBNA1 的突變抗原與佐劑 CpG，成功激起小鼠體內(nèi)魯棒性的體液免疫及特異性 T 細(xì)胞免疫，并對(duì)轉(zhuǎn)染 EBNA1 的小鼠肺癌細(xì)胞系起到了較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[49]。

二氧四氫喋啶合酶(Lumazine Synthase，LS)可自發(fā)形成含有 60 個(gè)亞基的二十面體納米顆粒，直徑約為 14.5 nm；來源于 KDPG 醛縮酶功能片段的 I3-01 也可自發(fā)形成二十面體納米顆粒，直徑約為 20 nm。這兩種納米顆粒均可在表面修飾特異性抗原，Kang 等[50]在 LS 及 I3-01 的二十面體表面均融合了 EB 病毒糖蛋白 gp350 的D123 片段，引起了比 gp350 單體高 65～133 倍的中和性病毒抗體，并激活了 Th2 輔助 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。這些工作說明，還存在其他潛在的、高效的、可工程化的納米顆粒疫苗平臺(tái)。

綜上，本文對(duì)近年來不同納米顆粒載體在EB 病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用做了相應(yīng)的總結(jié)評(píng)述，如表 1 所示。

表1 納米顆粒載體在 EB 病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用Table 1 Summary of nanoparticle-based EB virus vaccine candidates that have been developed

7 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了近年來國(guó)內(nèi)外利用納米顆粒為疫苗平臺(tái)對(duì) EB 病毒的預(yù)防及治療性疫苗方面的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了外泌體納米顆粒平臺(tái)、類病毒顆粒平臺(tái)、鐵蛋白自組裝納米顆粒平臺(tái)以及一些其他類型的納米顆粒在防治 EB 病毒中的應(yīng)用。雖然納米顆?；蚬こ碳夹g(shù)突破了傳統(tǒng)單一形式蛋白或多肽疫苗的技術(shù)瓶頸，并為 EB 病毒的有效防治提供了新工具，但納米顆粒在進(jìn)一步臨床應(yīng)用及轉(zhuǎn)化過程中仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，要保證平臺(tái)具有極高的生物安全性，需要檢測(cè)驗(yàn)證外泌體中非必要蛋白的組分，并采用工程化改造技術(shù)剔除所有副效蛋白等；類病毒顆粒雖不包含病毒復(fù)制 DNA，但也不能引入引起副效作用的任何潛在調(diào)節(jié)分子片段；EB 病毒自身的免疫原性較低，如何選擇 EB 病毒抗原并利用不同納米顆粒載體更全面地嵌合及展示多種病毒蛋白抗原，這些都是影響臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性問題。現(xiàn)有的納米顆粒平臺(tái)大多都未被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局正式批準(zhǔn)，潛在的生物安全性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，納米顆粒的大規(guī)?？煽刂苽浼兓夹g(shù)是臨床轉(zhuǎn)化的又一關(guān)鍵問題，包括外泌體、類病毒顆粒在內(nèi)的納米顆粒均需要真核表達(dá)系統(tǒng)的正確組裝，使得大規(guī)模生產(chǎn)面臨一定的技術(shù)挑戰(zhàn)。因此，如何設(shè)計(jì)出可在原核生物中正確表達(dá)的結(jié)構(gòu)單體、如何謹(jǐn)慎篩選組裝分子、嚴(yán)格挑選抗原分子，都是納米顆粒真正邁入臨床轉(zhuǎn)化所亟待解決的共同科學(xué)問題。