用于高分辨率成像的肺器官芯片構(gòu)建及肺炎模型應(yīng)用研究

辛 穎 徐寶琪 王軍杰 張榮榮 溫 慧 王金娟梁 帆 金 帆 梁 卓 黃建東,4* 黃術(shù)強*

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院 中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點實驗室 廣東省合成基因組學(xué)重點實驗室 深圳 518055)

2(廣東醫(yī)科大學(xué) 東莞 523808)

3(香港大學(xué)理學(xué)院 統(tǒng)計及精算學(xué)系 香港 999077)

4(香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院 香港 999077)

1 引 言

肺是人體與外界空氣進行氣體交換的重要器官，其基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)由支氣管反復(fù)分支形成的支氣管樹構(gòu)成。支氣管上皮作為肺的保護屏障，包含多種細(xì)胞類型，其中杯狀細(xì)胞能夠分泌黏蛋白，在上皮表面形成黏液性屏障，黏附流通進入支氣管的空氣所包含的異物顆粒，同時溶解有毒氣體。另一方面，支氣管上皮的纖毛能夠通過節(jié)律性的擺動將黏液及其上附著的粉塵、細(xì)菌等推向咽部，以痰的形式排出體外[1-2]。

由于人體呼吸道直接與外部環(huán)境相通，肺易遭受大氣污染物的刺激和破壞[3]，同時也容易受到病原微生物的侵襲[4-5]。其中，細(xì)菌和病毒所引起的肺部疾病最為常見，如肺炎球菌肺炎、銅綠假單胞菌肺炎等[6]。目前耐藥性細(xì)菌成為肺炎治療急需解決的關(guān)鍵問題之一[7]，同時，有些病原體的致病機制也尚未明確，這給臨床上肺部疾病的治療帶來了較大的挑戰(zhàn)。在對致病菌的機制研究中，細(xì)菌的遷移、黏附和侵襲等運動機制的研究可以幫助理解復(fù)雜疾病的致病機理，但是由于細(xì)菌體積較小，故其運動機制的研究往往依賴于高分辨成像技術(shù)。其中，基于高分辨成像技術(shù)，能夠更加直觀且實時觀測到細(xì)菌在人體細(xì)胞上發(fā)生的生理變化規(guī)律。對于肺部疾病致病機制和臨床前藥物開發(fā)的相關(guān)研究，目前常用的仍是體外細(xì)胞培養(yǎng)模型和哺乳動物模型[8]。但常規(guī)的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)難以反映體內(nèi)復(fù)雜的組織器官功能特點，也無法反映人體組織器官對外界刺激產(chǎn)生的真實響應(yīng)[9]。哺乳動物模型可以提供一定的體內(nèi)信息，但動物實驗周期長、成本高，與人體存在較大的種屬差異，因此對人體實際反應(yīng)的預(yù)測能力較差[10]。不僅如此，在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型和哺乳動物模型中幾乎無法對作用于其中的單個細(xì)菌進行分析觀察和實時成像，同時對于細(xì)菌的觀察也嚴(yán)重受限于目前常用的高分辨成像儀器的工作距離。人體器官芯片是近年來興起的多學(xué)科交叉新技術(shù)，將微流控技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)進行結(jié)合，能夠在微流控芯片上模擬人體器官的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境[11-13]，并已用于人類疾病發(fā)生和發(fā)展過程研究[14-15]、臨床藥物研發(fā)[16-17]以及體外生化診斷檢測[18]等。

在眾多人體器官芯片中，肺芯片是最早被提出和開發(fā)的器官芯片之一[19]。目前，肺芯片裝置多具有雙層通道，由聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)制成的微孔膜隔開，通過在膜的上表面培養(yǎng)人體肺上皮細(xì)胞并覆蓋空氣來模擬氣管，而在同一膜的對側(cè)培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞并覆蓋流動介質(zhì)來模擬血管，重建肺泡-毛細(xì)血管界面，模擬肺部微環(huán)境[20-21]，可研究肺芯片上細(xì)胞-細(xì)胞[22]、細(xì)胞-基質(zhì)[23]、細(xì)胞-病原體[24-26]等相互作用。在此基礎(chǔ)上，一些肺部疾病模型也得以在肺芯片上構(gòu)建，如慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)[27-28]、哮喘[29]、肺炎[30]、肺損傷[31]、肺纖維化[32]、肺癌[33]等，這在肺部相關(guān)疾病的研究和實現(xiàn)個性化診斷及治療上具有巨大的潛力。目前直觀地反映和分析微流控肺芯片上人體細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與病原體之間的相互作用需要借助高倍鏡下的顯微成像技術(shù)，而現(xiàn)有的肺芯片尺寸設(shè)計不能滿足高倍鏡低工作距離的要求，因此無法在高倍顯微鏡下對細(xì)菌清晰成像，限制了肺芯片上對細(xì)胞與細(xì)菌之間相互作用的研究。

本研究擬對現(xiàn)有的肺芯片制作工藝進行改良，構(gòu)建一種可用于高分辨率成像的肺器官芯片，通過采用人支氣管上皮樣細(xì)胞(16HBE 細(xì)胞)重現(xiàn)肺部黏液屏障來模擬肺部微環(huán)境。同時，將 16HBE 細(xì)胞與銅綠假單胞菌進行共培養(yǎng)，構(gòu)建一個簡易的銅綠假單胞菌感染模型，直觀觀察細(xì)菌在細(xì)胞上的運動與定位，為人體肺組織與細(xì)菌的相互作用研究提供一個簡便而有效的體外模型。

2 材料和方法

2.1 材料

聚二甲基硅氧烷(PDMS)單體與引發(fā)劑均購于美國 Dow Corning 公司；光刻膠 SU-8 2100 和SU-8 3050 均購于美國 Microchem 公司；三氯(1H, 1H, 2H, 2H-全氟辛基)硅烷購于美國 Sigma-Aldrich 公司；空白菲林片購于深圳清溢光電股份有限公司；16HBE 細(xì)胞購于國家實驗細(xì)胞資源共享平臺；MEM(Minimum Essential Medium)培養(yǎng)基、胎牛血清和鼠尾 I 型膠原蛋白均購于美國 Gibco 公司；青鏈霉素混合液、0.25% 胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)均購于美國 Hyclone 公司；ZO-1 抗體購于美國 Thermo Fisher Scientific 公司；DAPI 染色液購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；阿利新藍染色液購于北京索萊寶科技有限公司；等離子清洗儀購于美國 Harrick Plasma 公司；微量注射泵購于美國 Harvard Apparatus 公司；激光共聚焦顯微鏡為日本尼康公司生產(chǎn)制造；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國 Thermo Fisher Scientific 公司。

2.2 用于高分辨率成像的肺器官芯片制作

(1)SU-8 模板設(shè)計與制作

上通道和下通道 SU-8 模板制作：首先，將硅片放進等離子清洗儀中檔清洗 10 min。然后，利用勻膠機將光刻膠 SU-8 2100 鋪滿制作上通道的硅片，用 SU-8 3050 鋪滿制作下通道的硅片。其中，上通道的勻膠轉(zhuǎn)速為 1 300 r/min，下通道的勻膠轉(zhuǎn)速為 1 875 r/min，二者勻膠時間均為 30 s。鋪膠完成后，將硅片置于熱板上 95 ℃ 前烘 1 h。待硅片自然冷卻至室溫后，用事先打印好的芯片掩膜覆蓋于玻璃片 SU-8 膠層上，置于紫外光刻機下曝光。曝光后立即將掩膜去掉，將硅片置于熱板上 95 ℃ 后烘 20 min。待硅片自然冷卻至室溫，用顯影液進行顯影，溶去未經(jīng)曝光的 SU-8 光刻膠，顯影后用異丙醇清洗硅片模板，并用壓縮空氣將其吹干。最后，將模板放入烘箱內(nèi) 180 ℃堅膜 30 min。

微柱陣列模板制作：與上、下通道勻膠過程相似，先使用 SU-8 3035 光刻膠，勻膠速度為2 500～2 750 r/min，勻膠時間 30 s，95 ℃ 前烘20 min；隨后利用旋涂儀進行去邊操作，再前烘10 min，真空曝光，95 ℃ 后烘 5 min；最后，進行顯影和堅膜。

(2)上通道 PDMS 制作

將 PDMS 單體與引發(fā)劑以質(zhì)量比 10∶1 混合均勻，倒入上通道 SU-8 的模板上，真空抽氣除氣泡，在 80 ℃ 下烘 30 min，固化后將 PDMS 從模板上剝離。

(3)下通道 PDMS 及 PDMS 多孔膜制作

下通道及微柱陣列模板的硅烷化處理：首先，分別將裝有下通道模板和微柱陣列模板的干凈培養(yǎng)皿放入烘箱，80 ℃ 干燥 30 min；然后，用等離子清洗儀處理干燥后的模板，低檔處理10 min 后將其放入真空干燥器內(nèi)，將 20 μL 三氯(1H, 1H, 2H, 2H-全氟辛基)硅烷滴加到一片提前放置在真空干燥器內(nèi)的干凈載玻片上，隔膜泵抽真空 10 min；最后，關(guān)閉隔膜泵，關(guān)緊干燥器閥門，靜置 12 h 以上。

將 PDMS 單體和引發(fā)劑以質(zhì)量比 10∶1 混合均勻，放入玻璃罐內(nèi)抽真空除去氣泡后澆筑在下通道模板和多孔膜模板表面。隨后，將微柱陣列模板轉(zhuǎn)移到烘箱內(nèi)的水平臺上，于模板上面放一片經(jīng)等離子體高檔處理 5 min 的菲林片，并在其上放一塊厚 1 cm 的 PDMS 塊。緊接著在 PDMS壓塊上表面放置一塊厚玻璃，且在玻璃上表面壓上 1.5 kg 的砝碼，手動調(diào)節(jié)維持砝碼、PDMS 壓塊及微柱陣列區(qū)域保持同一中心軸，待 PDMS 壓塊不再滑動時即可。同時，在下通道模板上覆蓋相同處理的菲林片，再于其上放置一塊覆蓋通道結(jié)構(gòu)的磁鐵，下方放置另一塊磁鐵，使兩塊磁鐵平穩(wěn)地吸附起來，接著將整個裝置放置于烘箱內(nèi)。最后，將下通道 PDMS 及多孔膜結(jié)構(gòu)置于60 ℃ 烘箱內(nèi)固化 12 h。

待固化完成后，移去砝碼、磁鐵、厚 PDMS塊及玻璃，將菲林片與硅片模板分離，此時下通道 PDMS 及 PDMS 多孔膜均黏附在菲林片上。

(4)封接

首先，將上通道 PDMS 與附在菲林片上的PDMS 多孔膜進行等離子體封接，于 80 ℃ 烘箱內(nèi)烘 10 min 后，用手術(shù)刀將封接體從菲林片上切割后揭下，接著用打孔器在封接體上層通道PDMS 的兩個進樣端及兩個廢液端打孔；然后，將厚度為 170 μm 的蓋玻片與附有下通道 PDMS 的菲林片進行等離子體封接并放入 80 ℃ 烘箱內(nèi)烘10 min 后，使用手術(shù)刀去除其上附著的菲林片；最后，將兩次封接的產(chǎn)物進行等離子體封接，放入 80 ℃ 烘箱內(nèi)烘 10 min。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

16HBE 細(xì)胞采用含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液的 MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

肺芯片中的細(xì)胞培養(yǎng)：芯片在使用前進行紫外消毒 2 h。用 MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基將 3.55 mg/mL的鼠尾 I 型膠原蛋白稀釋為 30 μg/mL 的膠原溶液，將配制好的膠原溶液注入到芯片的通道內(nèi)，使其充滿通道且無氣泡產(chǎn)生，隨后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi) 2 h 進行表面膠原修飾。緊接著，將軟管與芯片連接，設(shè)置微量注射泵流速為 30 μL/h，過夜灌注完全培養(yǎng)基。用 0.25% 胰蛋白酶將16HBE 消化下來，再用 MEM 完全培養(yǎng)基將其重懸為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 107cell/mL 并接種于芯片通道內(nèi)。待 16HBE 細(xì)胞在通道內(nèi)沉降 2 h 后，設(shè)置微量注射泵流速為 30 μL/h 培養(yǎng)24～48 h。進行氣-液界面(Air-Liquid Interface，ALI)培養(yǎng)時，將上通道灌注的 MEM 完全培養(yǎng)基去除，更換為濕潤的空氣，以 30 μL/h 流速培養(yǎng)24～48 h，此時肺芯片中氣-液界面形成。

2.4 細(xì)菌培養(yǎng)

實驗所用的菌株由銅綠假單胞菌(PAO1,ATCC 15692)改造而來，導(dǎo)入質(zhì)粒 J23102-GFPPUCP22 可得到表達綠色熒光的菌株。

將凍存的菌種從－80 ℃ 冰箱取出置于冰上，于超凈工作臺內(nèi)使用無菌槍頭蘸取菌種，并在帶有慶大霉素抗性的苛養(yǎng)厭氧菌瓊脂(Fastidious Anaerobe Agar，F(xiàn)AA)平板上劃線，然后將其置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。第二日取出平板觀察菌落生長情況，挑取平板上生長旺盛且單獨生長的單菌落，接種于新鮮無菌的慶大霉素抗性的苛養(yǎng)厭氧菌肉湯(Fastidious Anaerobe Broth，F(xiàn)AB)培養(yǎng)基內(nèi)，200 r/min 搖菌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為 37 ℃)。

肺芯片中的細(xì)菌培養(yǎng)：在加入細(xì)菌前將已培養(yǎng)好 16HBE 細(xì)胞的肺芯片上、下通道使用的培養(yǎng)基更換為不帶抗生素的 MEM 完全培養(yǎng)基。將處于對數(shù)期的細(xì)菌菌液在室溫下以 5 000 r/min 離心 10 min。去除上清后，使用 MEM 完全培養(yǎng)基將細(xì)菌重懸到光密度為 0.4。然后，使用一次性1 mL 無菌注射器吸取細(xì)菌懸液，由上通道出口處注入芯片內(nèi)。待細(xì)菌沉降 5 min 后，設(shè)置注射泵流速為 30 μL/h 培養(yǎng)。在細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，將芯片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)菌的定殖情況。

2.5 細(xì)胞表征

(1)黏液：將肺芯片從培養(yǎng)箱內(nèi)取出并拆除外部管道，用 PBS 沖洗通道 3 次，再用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞 15 min。接著用 PBS 清洗通道3 次，向通道內(nèi)注入阿利新藍酸化液 A，室溫孵育 3 min 后，再向通道內(nèi)注入阿利新藍染色液B，室溫避光孵育 30 min。最后用 PBS 沖洗通道內(nèi)部殘留的染液，將芯片置于倒置相差顯微鏡下觀察。

(2)緊密連接：將肺芯片從培養(yǎng)箱內(nèi)取出并拆除外部管道，先用 PBS 沖洗通道 3 次，接著向通道內(nèi)注入 4% 多聚甲醛固定 15 min。然后，用PBS 沖洗通道以除去多聚甲醛，加入 0.2% Triton X-100 透化 10 min。再次使用 PBS 沖洗 3 次，注入 5% BSA (Bovine Serum Albumin)封閉 1 h。封閉后用 PBS 沖洗通道，加入 1∶100 稀釋的 ZO-1抗體 4 ℃ 孵育過夜。次日復(fù)溫后，PBS 沖洗 3 次洗去抗體，加入 DAPI 染色液孵育 5 min，用 PBS洗去染色液，避光于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 實驗結(jié)果

3.1 用于高分辨率成像的肺器官芯片性能評價

為構(gòu)建肺器官芯片，本文采用 SU-8 光刻技術(shù)制作了由 PDMS 組成的微流體裝置。PDMS 是一種具有較好理化性質(zhì)和生物兼容性的有機聚合物材料，其材質(zhì)偏軟且無毒，適合細(xì)胞的培養(yǎng)。本文中的微流控肺芯片結(jié)構(gòu)主要由上通道、多孔膜、下通道和蓋玻片 4 個部分組成。其中，芯片上微通道長 1 cm、寬 1 mm，上層微通道高 125 μm，類似于人類支氣管的半徑；下層微通道高 55 μm，上、下通道之間含有微柱陣列的多孔膜厚度為32.5 μm，細(xì)胞培養(yǎng)基可以通過灌注下通道給多孔膜上的細(xì)胞提供營養(yǎng)；雙通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計使芯片能夠形成氣-液界面，可模擬人體肺部氣道微環(huán)境。肺芯片制作流程如圖 1(a)所示。

圖1 肺芯片F(xiàn)ig. 1 Lung chip

目前大多數(shù)研究中使用的雙通道肺芯片在顯微鏡下觀察時，由于下通道結(jié)構(gòu)太厚，遠遠大于高倍物鏡的低工作距離，進而無法在高倍鏡下觀察細(xì)微的生物現(xiàn)象，如細(xì)菌在細(xì)胞表面的黏附、遷移等。為解決肺芯片中細(xì)菌在高倍鏡下的成像問題，本文對以往的肺芯片制作工藝進行了改進——將下通道高度降低為 55 μm，通道底部不再由 PDMS 封接，而是由厚度為 170 μm 的蓋玻片封接。這一設(shè)計工藝制作出來的肺芯片符合 60倍油鏡下成像的工作距離要求。肺芯片整體實物圖如圖 1(b～c)所示。

3.2 基于肺器官芯片的氣道上皮模型構(gòu)建

為了模擬人體肺支氣管上皮，本文采用Ⅰ型鼠尾膠原對芯片內(nèi)部進行修飾，在芯片中注入源于正常人支氣管上皮組織的人支氣管上皮細(xì)胞——16HBE 細(xì)胞進行液-液界面培養(yǎng)。為了促進肺氣道上皮細(xì)胞的分化、及更好地模擬肺部氣道的微環(huán)境，當(dāng) 16HBE 細(xì)胞生長鋪滿整個多孔膜并融合為一個組織界面時，將上層培養(yǎng)基去除，引入濕潤的空氣以形成氣-液界面。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，16HBE 能夠在肺芯片上正常生長，并且當(dāng)生長環(huán)境切換為氣-液界面時，16HBE 細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞脫落，保持與液-液界面細(xì)胞培養(yǎng)時相同細(xì)胞形態(tài)并且能夠持續(xù)增殖。16HBE 細(xì)胞在液-液界面培養(yǎng) 24 h 后的生長狀態(tài)如圖 2(a)所示，在氣-液界面培養(yǎng) 24 h、48 h后的生長狀態(tài)如圖 2(b、c)所示。

圖2 肺芯片內(nèi) 16HBE 細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的功能表征圖Fig. 2 Functional characterization of 16HBE cells in the lung chip under diあerent culture conditions

3.3 支氣管上皮功能表征

肺部黏液是肺組織的重要保護屏障。本文采用阿利新藍染色法鑒定肺芯片上黏液的產(chǎn)生。倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，肺芯片上氣-液界面培養(yǎng)切換前后細(xì)胞黏液的分泌量無明顯差異。如圖 2(d～f)所示。緊密連接是構(gòu)建細(xì)胞骨架的重要結(jié)構(gòu)，而緊密連接蛋白 ZO-1 是其重要組成蛋白之一。ZO-1 不僅能夠調(diào)節(jié)上皮屏障功能，還能維持上皮細(xì)胞極性。肺支氣管上皮細(xì)胞通過含有 ZO-1 的緊密連接而連接在一起。為了驗證肺芯片的生理功能，本研究在肺芯片上培養(yǎng)肺支氣管上皮細(xì)胞 16HBE，然后對芯片上的細(xì)胞進行免疫熒光染色。在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，被紅色染料標(biāo)記的 ZO-1 沿細(xì)胞頂端表面的外緣均勻分布且邊緣清晰，被藍色的 DAPI 染料標(biāo)記的細(xì)胞核清晰可見，并且轉(zhuǎn)換為氣-液界面培養(yǎng)的肺芯片與液-液界面培養(yǎng)條件下 16HBE細(xì)胞緊密連接蛋白的表達未見明顯差異，如圖 2(g～i)所示。

肺芯片上 16HBE 細(xì)胞緊密連接蛋白 ZO-1 的表達和黏液的分泌表明，本研究中構(gòu)建的肺芯片具有肺支氣管上皮細(xì)胞的功能，能夠用于后續(xù)實驗研究中。

3.4 肺芯片上的細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng)及高分辨率成像

銅綠假單胞菌肺炎是近年來醫(yī)院內(nèi)感染最常見的肺部炎癥之一。為了更直觀地觀察銅綠假單胞菌與人體細(xì)胞間的相互作用，本研究將肺芯片改造為符合高成像分辨顯微鏡 60 倍油鏡下成像工作距離要求的器官芯片。具體地，將帶有綠色熒光質(zhì)粒的銅綠假單胞菌接種在構(gòu)建好的肺上皮模型上，于 60 倍油鏡下實時觀察銅綠假單胞菌在16HBE 細(xì)胞上的定殖、遷移和黏附情況。細(xì)菌接種 5 min 后，連通注射泵去除未沉降的細(xì)菌。如圖 3 所示，經(jīng)過 20 h 的共培養(yǎng)后，細(xì)菌仍黏附在細(xì)胞表面，與 16 h 相比，細(xì)菌綠色熒光的表達顯著增多，能夠明顯觀察到細(xì)菌增殖并且主要定殖在細(xì)胞與細(xì)胞之間的區(qū)域。即改造設(shè)計后的肺芯片能夠清晰地觀察到細(xì)菌在肺支氣管上皮細(xì)胞上的定殖、遷移和黏附等。

圖3 肺芯片上的銅綠假單胞菌Fig. 3 Pseudomonas aeruginosa on a lung chip

為了進一步觀察肺芯片上細(xì)菌與人體細(xì)胞的相互作用，本文在銅綠假單胞菌與 16HBE 細(xì)胞共培養(yǎng) 14 h 后對肺支氣管上皮細(xì)胞的緊密連接 ZO-1 進行了表征。如圖 4 所示，在細(xì)菌侵染后，芯片內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞的緊密連接蛋白 ZO-1 的表達明顯降低。

圖4 共培養(yǎng)后肺芯片免疫熒光染色圖Fig. 4 Immunofluorescence staining of lung microarrays after co-culture

4 討論與分析

肺作為人體與外界環(huán)境進行氣體交換的重要場所，具有非常復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)。構(gòu)建一個能夠準(zhǔn)確反映肺部病理生理狀態(tài)的體外模型尤為重要。本研究使用的肺芯片是一種基于微流控技術(shù)的器官芯片，通過微流控裝置在器官芯片上進行流體下的氣-液界面培養(yǎng)來模擬肺部環(huán)境，可以作為一個反映肺部病理生理的體外模型。有研究表明，微流控器官芯片體系中持續(xù)流動的培養(yǎng)液能夠給細(xì)胞施加生理水平的流體剪切應(yīng)力[34]。本文還通過芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計，使芯片上的通道結(jié)構(gòu)類似于人體支氣管的半徑。另一方面，這種雙通道的肺器官芯片的設(shè)計，能夠使芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞處于氣-液界面培養(yǎng)環(huán)境，在一定時間內(nèi)使細(xì)胞保持良好的生理狀態(tài)和增殖活性，模擬了人體肺部氣道微環(huán)境。同時，本研究還對肺芯片上構(gòu)建的氣道上皮功能進行了一定的驗證：對肺芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞的緊密連接進行免疫熒光染色后觀察發(fā)現(xiàn)，氣-液界面構(gòu)建后緊密連接的表達無明顯影響，表明體系上肺支氣管上皮細(xì)胞不僅具有上皮屏障功能，還能夠分泌黏液——具有肺部黏液屏障的功能，較好地重現(xiàn)了肺部微環(huán)境。

目前，一些肺部疾病已經(jīng)在肺芯片上被成功構(gòu)建，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘。Benam 等[27]設(shè)計了一種肺芯片以模擬肺支氣管，通過構(gòu)建 COPD 模型，及利用 COPD 患者的細(xì)胞在體外重建疾病的重要特征，研究了吸煙對 COPD 患者健康的影響，結(jié)果顯示肺芯片在模擬肺部疾病、實現(xiàn)個體化診療方面具有巨大潛力[28]。Punde 等[30]建立仿生位系統(tǒng)模擬肺部微環(huán)境，檢測嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)對肺部炎癥的影響，發(fā)現(xiàn) ECP 能夠刺激 Beas-2B 細(xì)胞表達 CXCL 12，揭示了 CXCL 12-CXCR4 通路在肺炎中介導(dǎo) ECP 誘導(dǎo)的纖維細(xì)胞外滲的作用。目前在肺芯片體系下進行病原體與人體肺細(xì)胞相互作用的研究相對來說還較少，其中一個比較重要的原因是目前已報道的肺芯片無法在高倍物鏡下進行細(xì)菌與細(xì)胞相互作用的觀察。肺疾病模型的成功建立不僅與細(xì)胞類型、流體流動條件、病原體與肺細(xì)胞或組織的相互作用等因素相關(guān)，還需用高分辨率顯微鏡成像技術(shù)對細(xì)胞和細(xì)菌相互作用的變化進行實時觀察。本研究通過對肺芯片制作工藝的改進，以銅綠假單胞菌為例，在改進后的肺芯片上建立一個簡易的銅綠假單胞菌肺炎模型，高倍油鏡下對其進行實時觀察發(fā)現(xiàn)，可看到單個細(xì)菌在細(xì)胞上的運動。同時，本文還通過緊密連接蛋白 ZO-1 的免疫熒光染色表征了銅綠假單胞菌對肺支氣管上皮細(xì)胞 16HBE 細(xì)胞骨架的破壞作用。

需要說明的是，本文在肺芯片功能上的驗證還存在一些不足，如對細(xì)胞在肺芯片上的活性沒有進行定性和定量實驗，對細(xì)菌的生長特性也還沒有進行系統(tǒng)性的分析。此外，對肺芯片上銅綠假單胞菌與肺支氣管上皮細(xì)胞的相互作用還需進一步探究。

5 小 結(jié)

本文描述了一種基于微流控技術(shù)的雙通道肺器官芯片技術(shù)，通過改造肺芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計，使其能夠滿足高倍油鏡的工作距離，實現(xiàn)高分辨率成像；采用人體肺支氣管上皮細(xì)胞 16HBE 模擬人體氣道上皮組織，通過氣-液界面的切換在肺芯片上模擬人體呼吸系統(tǒng)的氣道微環(huán)境，驗證了所構(gòu)建的肺芯片具有人體氣道上皮的細(xì)胞極性和細(xì)胞功能，并在這一體系上實現(xiàn)了細(xì)菌與細(xì)胞的共培養(yǎng)以及相關(guān)生理現(xiàn)象的實時觀察，能夠模擬肺部炎癥疾病。本研究能夠為體外研究細(xì)菌和細(xì)胞的相互作用提供一個便捷有力的工具。