倒置濾膜法測(cè)定水質(zhì)中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌

馬 凱 鄧 婕 左 嘉 劉 悅 王秋水 袁立艷 白文波 高麗娟*

(1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心）, 北京 100089； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens),又稱魏氏梭菌(Clostridium welchii), 是一種革蘭氏陽性桿狀厭氧菌(G+), 廣泛存在于空氣、污水、土壤、各種食品以及動(dòng)物和人類的胃腸道中[1]，是典型的毒素致病菌[2]，也是人類氣性壞疽的主要病原菌，會(huì)導(dǎo)致食源性疾病、食物中毒、非食源性腹瀉等疾病[3]。該細(xì)菌產(chǎn)芽孢，在極端條件下如高溫高壓、消毒劑、輻射等會(huì)產(chǎn)生抗逆性[4，5]，在處理污水時(shí)不易殺死，導(dǎo)致飲用水易受微生物污染，所以檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌是評(píng)價(jià)水資源污染程度的重要指標(biāo)[6，7]。

目前國內(nèi)外對(duì)于飲用水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢測(cè)指標(biāo)還不夠明晰。GB/T 5749?2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（CFU/100 mL）的限制為0[8]，在GB/T 5750.12?2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》中并未規(guī)定其檢驗(yàn)方法[9]。GB 8537?2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》規(guī)定引用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（CFU/50 mL）的限量為n=5、c=0、m=0[10]。歐盟理事會(huì)98/83/EEC中采用濾膜法加厭氧培養(yǎng)法檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌[11]，ISO 6461?1:1986還原亞硫酸鹽的厭氧菌（梭菌屬）芽孢的檢測(cè)和計(jì)數(shù)中采用液體培養(yǎng)基增菌法，6461?2:1986采用膜濾法，兩部標(biāo)準(zhǔn)均是檢測(cè)梭菌屬（芽孢），不是針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法。英國國家標(biāo)準(zhǔn)EN 26461?1:1993和26461?2:1993是在前兩者基礎(chǔ)上的更新版本，非針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法。AOAC 976.30食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢測(cè)方法通過選擇性培養(yǎng)基TSC分離和富集出典型菌落，然后挑取一定比例典型菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)，按比例計(jì)算出樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的數(shù)量[12,13]。美國標(biāo)準(zhǔn)AOAC 993.10貝類產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的測(cè)定，通過MPN法與IMM法結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的定量[14]，加拿大國家標(biāo)準(zhǔn)MFHPB?2、3[15]和日本《食品安全檢測(cè)指南·微生物篇修訂第2版2018》標(biāo)準(zhǔn)是通過選擇性培養(yǎng)分離出產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌再進(jìn)行計(jì)數(shù)。國內(nèi)關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法主要有平板計(jì)數(shù)法、濾膜法和環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR的方法，PCR檢測(cè)方法主要應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中，此方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，在臨床上可以做出早期的快速診斷，為臨床早期治療提供依據(jù)。而傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法和濾膜法分別用于食品或者水中的檢測(cè)，相對(duì)成本較低，檢測(cè)的準(zhǔn)確性相對(duì)較高，適用于采用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌作為指示菌來檢測(cè)水中病原微生物[16]。

對(duì)現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匯總對(duì)比以及常用檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的方法發(fā)現(xiàn)，目前缺乏專門針對(duì)飲用水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌明確的檢測(cè)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)，且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、所用培養(yǎng)基較多等缺點(diǎn)[17,18]。因此，本研究基于國家標(biāo)準(zhǔn)采用濾膜法，通過濾膜過濾一定體積水樣，將菌截留在濾膜上，將濾膜培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上，根據(jù)產(chǎn)生的典型菌落形態(tài)選取可疑菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，并對(duì)該方法精密性、準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察，以證明此方法具有普遍性、科學(xué)性、先進(jìn)性和適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SQP型電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); BHC?1600 IIA/B3型生物安全柜(AIRTECH蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); AW200SG型厭氧培養(yǎng)工作站(英國依萊泰科公司); LRH?150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；pH計(jì)；冰箱；恒溫水浴鍋；顯微鏡；微生物鑒定系統(tǒng)；無菌濾器。

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens,CICC 22949)、蛋白胨、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基( FT )、硫酸亞鐵、新鮮全脂牛奶、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、硝酸鹽還原試劑、生化鑒定試劑盒，試劑均為北京陸橋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 濾膜法

采用濾膜過濾器過濾水樣，使水樣通過孔徑為 0.45 μm的濾膜過濾，細(xì)菌被阻留在膜上，將濾膜的截留面朝下貼在SPS培養(yǎng)基或TSC培養(yǎng)基上，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)18~24 h后，計(jì)算黑色菌落數(shù)，挑選5個(gè)典型菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌是能夠分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)卵磷脂酶分解卵黃中的卵磷脂，液化明膠的革蘭氏陽性桿菌，結(jié)合確證試驗(yàn)結(jié)果與計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算得到100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)[21]。

1.2.2 培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度優(yōu)化

潛在的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色是判定可疑菌落的關(guān)鍵，是確證試驗(yàn)的基礎(chǔ)。為使目標(biāo)菌菌落呈現(xiàn)黑色，需將現(xiàn)行培養(yǎng)基中亞硫酸鹽濃度提高1倍，即每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽。本研究中使用的SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽成分作為補(bǔ)劑單獨(dú)保存，在使用時(shí)添加1支補(bǔ)劑。

1.2.3 濾膜放置的方式優(yōu)化

在現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中，水樣濾膜后濾膜的截留面朝上放置培養(yǎng)、或是濾膜的截留面朝上放置培養(yǎng)結(jié)合加注瓊脂等[19,20]。濾膜的截留面朝下倒置培養(yǎng)，對(duì)比濾膜正置培養(yǎng)或加注瓊脂法，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌在在瓊脂上呈現(xiàn)黑色效果更顯著，選擇性更強(qiáng)，容易辨別。

1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證單位和試驗(yàn)用水的選擇

從全國范圍內(nèi)選擇5家檢測(cè)機(jī)構(gòu)作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證單位進(jìn)行試驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度驗(yàn)證。試驗(yàn)用實(shí)際水樣來自覆蓋全國范圍的珠江、長(zhǎng)江、黃河、淮河、遼河、海河、松花江等七大水系。

1.2.5 濾膜法的精密度實(shí)驗(yàn)

按照3種水樣（末梢水自來水、水源水水庫水和河水）分別接種低、中、高3個(gè)濃度的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌制備樣品，進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌濾膜法的檢測(cè)，每種水樣低、中、高濃度平行測(cè)定 6 次，分別計(jì)算樣品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[19，20]。

1.2.6 濾膜法的準(zhǔn)確度驗(yàn)證

對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品（可接受范圍為1000 CFU~5000 CFU）進(jìn)行兩次重復(fù)測(cè)定。對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定，一共采集了110份水源水（河水、水庫水）、末梢水（自來水）樣品，其中38份自來水樣品、36份水庫水樣品、36份河水樣品[21]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

(1) 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計(jì)數(shù)[22]：

對(duì)濾膜上確證為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(2) 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計(jì)算：

根據(jù)檢驗(yàn)用樣品量，按下式計(jì)算出每100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌落數(shù)，結(jié)果以CFU/100 mL計(jì)。

每100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)（CFU/100 mL）=

式中：

A——可疑的黑色菌落數(shù)，CFU；

B——確證為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落數(shù)，CFU；

C——用于確證試驗(yàn)的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落數(shù)，CFU；

d——100 mL過濾水中實(shí)際包樣品的量，100 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基構(gòu)成優(yōu)化結(jié)果

SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的作用是使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生黑色菌落，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌可還原亞硫酸鹽為硫化物，硫化物與鐵反應(yīng)生成黑色硫化鐵，使菌落中心呈黑色。本研究使用的SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度為每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加50 mg亞硫酸鹽，通過標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，濾膜截留面朝上放置培養(yǎng)后的黑色菌落不明顯，多數(shù)菌落呈現(xiàn)灰色或黃色（圖1）。同樣實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)一步將亞硫酸鹽的濃度加倍，使得每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽，濾膜上菌落黑色程度改善不明顯。

圖1 濾膜截留面朝上培養(yǎng)，亞硫酸鹽單倍濃度

在濾膜上方加注一層瓊脂可以使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌在瓊脂上的菌落呈現(xiàn)黑色。但是加注瓊脂會(huì)帶來諸多不便，如注時(shí)會(huì)出現(xiàn)將濾膜上截留的菌沖起來的情況，被沖起來的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落同樣存在菌落黑色不明顯或不顯黑色；加注一層瓊脂后，會(huì)為后續(xù)接種針穿過瓊脂挑取可疑菌落增加難度，如雜菌較多時(shí)，會(huì)出現(xiàn)挑取的菌落不純的情況。

將濾膜的截留面朝下倒置，貼合培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以緩解避免上述問題。并且與正置培養(yǎng)相比，菌落黑色程度增加，進(jìn)一步將SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度加倍，使得每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽后，幾乎濾膜上所有菌落都會(huì)呈現(xiàn)明顯黑色，容易辨別。如圖2所示。

圖2 濾膜截留面朝下培養(yǎng)，亞硫酸鹽加倍濃度

2.2 濾膜法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)室低、中、高濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.1%~19.1%，3.1%~19.0%，3.1%~22.4%。具體見表1、表2、表3所示。

表2 加標(biāo)的精密度測(cè)定結(jié)果（n=6）

表3 加標(biāo)的精密度測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.3 濾膜法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定質(zhì)控樣品結(jié)果顯示相對(duì)誤差范圍為?32.0%~110.0%；相對(duì)誤差最終值為22.8%±62.8%。110份實(shí)際樣

品檢測(cè)中檢出樣品21個(gè)，結(jié)果范圍為0~180 CFU/100 mL。測(cè)定實(shí)際樣品結(jié)果具體見表4和表5。

表4 質(zhì)控樣品的測(cè)定表

表5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

通過改善SPS培養(yǎng)基成分構(gòu)成，將培養(yǎng)基亞硫酸鹽濃度提升為100 mg/每100 mL，結(jié)合將濾膜的截留面朝下倒置與培養(yǎng)基貼合培養(yǎng)，可以使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生明顯的黑色菌落，選擇性更強(qiáng)，更便于菌落計(jì)數(shù)和進(jìn)一步的確證試驗(yàn)的進(jìn)行。

倒置濾膜法測(cè)定水質(zhì)中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌方法的建立，通過6家實(shí)驗(yàn)室，分析全國不同水系水樣，得出該方法的精密度、準(zhǔn)確度良好, 滿足標(biāo)準(zhǔn)要求, 可用于實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)檢驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不涉及特殊大型儀器設(shè)備，且檢測(cè)成本低，實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)難度不大，容易理解和掌握，適合全國各地不同發(fā)展技術(shù)水平實(shí)驗(yàn)室操作，具有科學(xué)合理性、適用性和普及性。