喉鱗狀細(xì)胞癌組織中IDO1和PD-L1的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

高艷菊，申遼遼

榆林市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 榆林 719000

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其主要病理類(lèi)型為喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC)，占全世界所有惡性腫瘤的比例約為2%[1-2]。近年來(lái)，LSCC的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)，但致病原因目前尚不明確。吲哚胺2，3-雙加氧酶1(Indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1)是催化色氨酸生成Kynurenine的限速酶，在色氨酸的代謝中起關(guān)鍵作用[3]。據(jù)報(bào)道，色氨酸的消耗和Kynurenine的積累可誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡和功能障礙，并產(chǎn)生免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[4]。IDO1表達(dá)在人類(lèi)食管癌[5]、卵巢癌[6]等多種類(lèi)型的惡性腫瘤中升高，往往與不良預(yù)后有關(guān)。程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)最初在2000年被鑒定，是腫瘤微環(huán)境中致癌信號(hào)或動(dòng)態(tài)干擾素γ表達(dá)的結(jié)果，被認(rèn)為是一個(gè)免疫檢查點(diǎn)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的PD-L1在體外和體內(nèi)可以增加T細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞不被殺死[8]。目前，IDO1和PD-L1的表達(dá)與LSCC的相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)IDO1和PD-L1在LSCC組織中的表達(dá)情況，并分析IDO1和PD-L1表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，從而為L(zhǎng)SCC的診療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)2012年6月至2013年6月期間在榆林市第二醫(yī)院首次診斷為L(zhǎng)SCC患者的臨床資料進(jìn)行回顧性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理組織學(xué)確診為L(zhǎng)SCC[9]；(2)均為初治患者，且已行手術(shù)治療；(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾接受過(guò)任何抗癌治療者(包括放療/誘導(dǎo)化療)；(2)既往/同步惡性腫瘤史者；(3)已知活動(dòng)性炎癥性疾病(包括自身免疫性疾病和感染)或活動(dòng)性肝或腎疾病。經(jīng)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，總共有85例LSCC患者納入本研究，其中男性83例，女性2例；年齡37～79歲，平均(63.1±4.3)歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年列出的頭頸部腫瘤組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)[10]：高分化35例，中分化31例，低分化19例；頸部淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移34例，無(wú)轉(zhuǎn)移者51例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期60例。術(shù)中取距離腫瘤至少0.5 cm以上且經(jīng)病理檢查確定為喉正常組織的28例標(biāo)本為對(duì)照組[9]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化染色 將石蠟切片在100℃檸檬酸三鈉緩沖液中加熱20 min，用于抗原修復(fù)。將切片與IDO1抗體和PD-L1抗體在室溫下孵育2 h。小鼠抗人IDO1單克隆抗體和小鼠抗人PD-L1單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。然后，將切片與二抗在室溫下孵育30 min。NBT/BCIP色劑顯色5 min，隨后使用蘇木素染色，脫水，清除，中性膠封，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷 光鏡下，細(xì)胞質(zhì)背景清晰，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒。本實(shí)驗(yàn)觀察到的IDO1和PD-L1陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞的比例，取其平均值。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為陰性(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤30%為弱陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤60%為陽(yáng)性(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞60%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。統(tǒng)計(jì)時(shí)將(+)～(+++)均作為表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 隨訪 患者術(shù)后每隔3～6個(gè)月復(fù)查1次，根據(jù)復(fù)查結(jié)果診斷是否復(fù)發(fā)，必要時(shí)行手術(shù)確診。臨床醫(yī)師結(jié)合醫(yī)院門(mén)診復(fù)查病例資料及電話(huà)進(jìn)行隨訪，隨訪至患者死亡或2019年9月30日。生存時(shí)間分別定義為從手術(shù)之日起至死亡之日或隨訪截止日期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCC組織與癌旁組織中IDO1和PD-L1的表達(dá)水平比較 IDO1和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色或棕褐色著色，在LSCC組織中著色明顯(圖1、圖2)。IDO1和PD-L1在LSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中IDO1和PD-L1的表達(dá)水平比較

圖1 IDO1在LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×400)

圖2 PD-L1在LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×400)

2.2 IDO1表達(dá)與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系 IDO1陽(yáng)性表達(dá)與LSCC患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.05)；而與患者的性別、年齡和腫瘤生長(zhǎng)部位無(wú)關(guān)(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 IDO1表達(dá)與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 PD-L1表達(dá)與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系 PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與LSCC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.05)；而與患者的性別、年齡和腫瘤生長(zhǎng)部位無(wú)關(guān)(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 PD-L1表達(dá)與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 IDO1和PD-L1在LSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IDO1陽(yáng)性表達(dá)和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)在LSCC腫瘤組織中呈正相關(guān)(r=0.527，P=0.021)，見(jiàn)圖3。

圖3 LSCC組織中IDO1和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)性圖

2.5 IDO1和PD-L1表達(dá)與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系 按IDO1或PD-L1表達(dá)情況將85例LSCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中47例IDO1陽(yáng)性患者歸為高表達(dá)組，38例IDO1陰性患者歸為低表達(dá)組；53例PD-L1陽(yáng)性患者歸為高表達(dá)組，32例PD-L1陰性患者歸為低表達(dá)組。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析，分別繪制不同IDO1、PD-L1表達(dá)的LSCC患者的生存曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，到隨訪截止時(shí)間，IDO1或PD-L1低表達(dá)組患者的平均總生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于高表達(dá)組患者(IDO1：45.5個(gè)月vs39.6個(gè)月；PD-L1：46.3個(gè)月vs38.8個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 LSCC患者不同IDO1、PD-L1表達(dá)組的生存曲線(xiàn)

3 討論

LSCC是喉癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，占喉癌總數(shù)的90%以上[11]?，F(xiàn)階段，LSCC的主要治療策略仍然是手術(shù)或全喉切除加放療的方式，盡管隨著科技手段的進(jìn)步和生物臨床治療理論的更新，使得LSCC患者的生存率有所提高，但LSCC異質(zhì)性高、侵襲性強(qiáng)，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于晚期，治療手段有限，因此導(dǎo)致大多數(shù)的LSCC患者預(yù)后不良[12]。近年來(lái)免疫治療的興起為晚期惡性腫瘤患者的治療提供了可能，但是，“狡猾”的腫瘤細(xì)胞在其進(jìn)化過(guò)程中選擇性轉(zhuǎn)錄某些基因，以抑制T細(xì)胞功能，使其喪失對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[13]。因此，研究并闡明腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的分子機(jī)制對(duì)惡性腫瘤的治療極其重要。

IDO1是一種重要的先天免疫調(diào)節(jié)因子，其過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致色氨酸耗竭和代謝產(chǎn)物的積聚，進(jìn)而抑制效應(yīng)T和NK細(xì)胞的分化和激活，為腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視提供條件[14]。此外，IDO1在感染、炎癥或細(xì)胞因子的作用下表達(dá)上調(diào)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)LSCC組織中IDO1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，IDO1表達(dá)與LSCC患者TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)，且IDO1陽(yáng)性表達(dá)與LSCC患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。在LSCC中，高表達(dá)的IDO1促進(jìn)細(xì)胞中色氨酸的過(guò)度代謝，抑制效應(yīng)T和NK細(xì)胞的分化和激活，導(dǎo)致LSCC的惡性進(jìn)展。由此表明，IDO1可能是LSCC細(xì)胞中一個(gè)促進(jìn)腫瘤進(jìn)程，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測(cè)的癌基因。IDO1陽(yáng)性表達(dá)可作為評(píng)估LSCC患者預(yù)后不良的因子，IDO1可能成為判斷LSCC患者預(yù)后的輔助標(biāo)志物。

PD-1是CD28家族的一個(gè)免疫抑制性輔助信號(hào)受體，可以在被激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)它的存在[16]。PD-1的功能主要受其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的調(diào)控，包括基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)和基于免疫受體酪氨酸的開(kāi)關(guān)基序(ITSM)，當(dāng)PD-1識(shí)別其配體PD-L1時(shí)，這種相互作用誘導(dǎo)ITSM中酪氨酸殘基的磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶分子則被招募使下游的效應(yīng)分子去磷酸化，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。PD-1下調(diào)T細(xì)胞活性，影響負(fù)性免疫應(yīng)答，當(dāng)腫瘤微環(huán)境中PD-1與PD-L1結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞功能減弱，致使抗腫瘤反應(yīng)結(jié)果受到強(qiáng)烈抑制，并有利于腫瘤逃避。研究發(fā)現(xiàn)，與雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌相比，在三陰性乳腺癌中顯示出更高水平的PD-L1表達(dá)[18]。同樣的，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，PD-L1的高表達(dá)幫助肺癌腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測(cè)，促進(jìn)其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19]。本研究顯示LSCC組織中PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，PD-L1表達(dá)與LSCC瘤患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)，且PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)與LSCC患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明，在LSCC微環(huán)境中，PD-L1/PD-1信號(hào)通路可能通過(guò)抑制T細(xì)胞活性，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測(cè)，從而促進(jìn)LSCC腫瘤細(xì)胞的生存發(fā)展。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析顯示，在LSCC腫瘤組織中，IDO1陽(yáng)性表達(dá)和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，IDO1和PD-L1在LSCC患者癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率升高，可能協(xié)同參與LSCC的免疫逃逸，與LSCC惡性行為有關(guān)，且IDO1和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后不良，有可能作為L(zhǎng)SCC患者診療靶標(biāo)和預(yù)后輔助標(biāo)志物。但本研究仍然存在著一些不足之處：(1)單一中心的樣本數(shù)量較少，研究結(jié)果可能存在一定的偏差。(2)LSCC腫瘤組織的標(biāo)本存放時(shí)間存在差異，可能導(dǎo)致組織中IDO1和PD-L1的免疫組化檢測(cè)結(jié)果存在偏差，影響結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。今后將進(jìn)一步完善研究方法和策略，以期獲取更加全面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和結(jié)論。