骨髓間充質干細胞在牽張成骨中遷移調控機制的研究進展

蔡杰欽 綜述 魏波 審校

廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科中心，廣東 湛江 524000

牽張成骨是骨再生技術的一種，其原理為將骨皮質切開，施加持續(xù)而穩(wěn)定的骨牽張力于骨皮質斷端，促進張力微環(huán)境下成骨系細胞的增殖，刺激新骨生成[1]。在研究中發(fā)現(xiàn)，牽張成骨過程中，除骨組織再生外，也同時存在肌肉、血管和神經等軟組織的生成，可有效發(fā)揮自身再生機能[2]。然而AL-NAMNAM等[3]認為，牽張成骨應用過程中同樣存在一系列弊端，如治療時間長，出現(xiàn)針道感染、成骨不全、牽張器脫落和神經損傷等風險事件的發(fā)生率，長時間的佩戴牽引器也會影響患者的日常生活。分析其原因是臨床工作者尚未完全地明確牽張成骨機制。然而，謝玉等[4]和卓麗丹等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，牽張成骨與骨髓間充質干細胞關系密切，正常生理狀態(tài)下可在脊髓血管干細胞龕中發(fā)現(xiàn)骨髓間造血干細胞的存在。牽張應力為牽張成骨新骨形成創(chuàng)造條件，骨髓間充質干細胞在此基礎上自干細胞龕遷移至骨形成處[6]。如此一來，對骨髓間充質干細胞在牽張應力下的遷移機制進行探討，便可為把握牽張成骨機制和解決技術瓶頸打下良好基礎。王琳等[7]開展的一項研究顯示，應力微環(huán)境可激活促分裂素原活化蛋白激酶、細胞外信號調節(jié)激酶1/2和哺乳動物雷帕霉素靶向基因，使后者對細胞增殖、分化和遷移等生物學反應進行調控。但上述分子通路對牽張成骨的作用尚未形成明確定論。本文對三種分子的表達及對應信號分子在牽張應力下在骨髓間充質干細胞遷移中的作用予以探討，以加深對應力狀態(tài)下骨髓間充質干細胞的了解程度，提高牽張成骨的臨床應用價值。

1 牽張成骨臨床應用

牽張成骨最先由意大利學者伊利扎洛夫提出，在股骨牽張術中取得了良好的效果，但術后并發(fā)癥同樣不容忽視[8]。受當時技術條件和醫(yī)療水平的影響。相關工作者對牽張成骨的研究只限于表面，使得牽張成骨在之后相當長的一段時間內未在臨床中得到廣泛應用[9]。二十世紀五十年代，有學者在開展了大量研究的前提下，提出“張力-拉力法則”，為牽張成骨提供了理論基礎，也以此為前提形成了科學規(guī)范的使用原則和技術要求[10]。在二十世紀八十年代早期，該技術首先傳入意大利，隨后AO組織將其在世界范圍內推廣[11]。如今，隨著臨床工作者對該技術探討的不斷深入，牽張成骨技術已在骨外科、整形外科、頜面外科的疾病治療中被廣泛應用[12]。在通常情況下，牽張成骨的過程主要分三個階段[13]：潛伏期、搬移期、固化期。潛伏期是截骨術后至搬移期開始前時期，一般為5～7 d。此時的生物活性與骨折愈合初期相似，主要表現(xiàn)為血腫形成，骨折斷端的骨細胞、破損的骨膜和周圍細胞發(fā)生壞死，并釋放多種成骨因子。搬移期，利用外固定支架以恒定的速度持續(xù)穩(wěn)定的牽張分離兩截骨端，在外界持續(xù)穩(wěn)定的機械牽張刺激下，搬移區(qū)的成骨性因子和成骨性細胞始終保持高水平和高活性狀態(tài)，持續(xù)刺激搬移區(qū)的骨質再生[14]。

牽張成骨術可以在新生骨周圍形成有效的血運。具有成骨效果的長期穩(wěn)定性牽張成骨無需植骨、創(chuàng)傷小，周圍軟組織可同期擴張，主要用來治療骨與軟組織較大缺損、感染性骨不連、肢體不等長以及肢體畸形等[15]。

牽張成骨技術臨床應用價值極高，發(fā)展前景光明，使得相關工作者加大了對該技術的研究力度。目前該技術存在治療時間過長的不足，在給患者造成諸多不便的同時，還極大的提高了治療周期中發(fā)生感染、關節(jié)攣縮、成骨不佳等風險[16]。為此，臨床工作者開始探索縮短治療時間，保證治療效果的方式，成效明顯。

2 動物模型建立和臨床效能應用

在研究促進牽張成骨成骨質量的各種實驗中，不同的動物模型對實驗結果勢必造成一定的不確定性，對從事牽張成骨技術相關研究難度較大[17]。有人開始將大鼠作為動物模型，在大鼠股骨骨折中成功運用牽張成骨技術，因大鼠飼養(yǎng)方便、試劑豐富，可為更為廣泛而深入的研究提供方便，也為廣大學者所接受，從而為該技術的研究提供了較好的平臺[18-19]。

在牽張部位使用有助于細胞增殖、軟組織修復和骨組織生成的生理活性制劑，促使新骨生成，軟組織再生，發(fā)揮牽張成骨術作用的關鍵[20]。因此臨床學者不斷嘗試用生長因子、富血小板血漿、甲狀旁腺激素和缺氧誘導因子等生物制劑，以提高牽張成骨技術臨床效能，均為相關動物實驗所證實，成效明顯。AGARWAL等[21]認為，生長因子類型多樣，分為神經生長因子、血管內皮生長因子和胰島素樣生長因子，生物學功能廣泛，既可自行分泌，也能經內分泌方式發(fā)揮作用，利于細胞生長、增殖、分化和遷移，為廣大研究者所接受，應用前景廣泛。柳玉曉等[22]學者在研究中發(fā)現(xiàn)，在牽張成骨動物模型中使用神經生長因子，可有效恢復神經功能；局部注射纖維細胞生長因子，有助于新骨骨量和密度的提升。富血小板血漿可對牽張區(qū)進行覆蓋，降低術去暴露風險，可預見其對軟組織的積極影響。

從當前階段的發(fā)展形勢看，生物制劑仍在動物實驗階段應用，臨床研究有關的報道有限，主要是因為牽張部位中生物制劑停留時間有限，對周圍組織和成骨組織作用有限，臨床應用受限。這就需要臨床探討使用生物制劑提高牽張成骨作用效能的方式，同時對其他提高途徑予以探討。

牽張加力時，骨斷端和截斷區(qū)充滿骨髓間充質干細胞血管內皮細胞和成骨細胞，在刺激新骨生成，構建結締組織、恢復周圍軟組織等方面發(fā)揮著重要作用[23]。在此背景下，學者將益于神經、肌肉和成骨等組織功能恢復的基因導入成骨系細胞，可更好地發(fā)揮該技術新骨生成能力和促進軟組織修復的作用，這也是牽張成骨術的重點研究方向[24]。張同威等[25]在兔下頜牽張區(qū)注入堿性成纖維細胞生長因子，結果顯示牽張成骨的骨再生能力明顯提升。一項研究將神經生長因子β導入間充質干細胞中，將其注入兔下頜骨牽張間隙，使得下槽牙神經功能得到明顯恢復[26]。成骨系細胞是成骨研究中的重點，但現(xiàn)有技術水平低、免疫排斥和自體骨髓間充質干細胞獲得難度大等因素的影響，使得成骨系細胞臨床應用受限，需深入探討，以促進技術水平的提升[27]。

組織工程技術在牽張成骨術中前景光明，通過制成各種材料來搭載生物制劑、成骨系細胞，為細胞增殖和分化提供微環(huán)境，以發(fā)揮牽張成骨術臨床效能[28]。天然多聚物、無機材料、合成聚合物和納米材料均屬于現(xiàn)階段常用的載體材料，在恢復神經功能、獲取新生骨組織方面起著重要作用[29]。但將納米材料作為載體材料尚處于初步階段，需行廣泛而深入的探討。

3 牽張成骨機理研究進展

牽張成骨同時以骨再生和軟組織生長為目標，形成足量新骨是其成功的關鍵。它包括軟骨內成骨、膜內成骨和類軟骨樣成骨三種成骨方式，以膜內成骨為主，與骨折后新骨形成差別較大[30]。從組織學方面看，成骨是在張應力下大量合成與分泌膠原纖維，期間伴隨鄰近血管侵入、骨髓間充質干細胞遷移至新骨形成區(qū)，成軟骨向分布，促使骨截斷區(qū)生成新骨，使得骨小梁長大、合成并成熟，實現(xiàn)骨再生的目標[31-32]。牽張成骨分子機制尚未形成明確結論，但促炎性細胞因子、促血管生長因子和轉化生長因子-β超家族成員在牽張加力過程中發(fā)揮著重要的調控作用[33]。白細胞介素-1和白細胞介素-6可對膜內成骨進程予以調控；促生長因子可刺激成骨系細胞的成骨向分化，利于骨組織再生。腫瘤壞死因子-α可對免疫反應和炎癥反應予以調控，也可調控牽張成骨中骨重建。轉化生長因子-β可對骨形成過程中成骨系細胞分化能力進行調控，血管內皮生長因子可促進血管形成，在骨牽張形成中作用明顯[34]。由此可以看出，外部使用上述因子，可充分發(fā)揮牽張成骨臨床效能。但其臨床應用很少取得成功，主要是因為調控機制和成骨系細胞機制尚未明確。

應力在機體上的作用是以應力傳導為基礎，應力傳導指的是外界應力微環(huán)境在細胞上發(fā)揮作用，使得細胞應力感受器被激活，引發(fā)生物化學反應，將外界應力信息轉化為內部分子信號，引起細胞特定反應的生物學進程[35]。肌細胞、內皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞等均可感受到力學刺激，并由之激活。如此一來，外力加載骨組織應力傳導過程后，引起骨組織內微環(huán)境間質液流動，使得剪切應力產生，激活病傳遞內部信號至周圍細胞。然而牽張力是施加在骨斷端處，骨組織和周圍軟組織在此過程中同時生長，無法對應力傳導過程作出準確解釋[36]。

細胞應力感受器捕捉并向下傳導細胞對外界的應力刺激，整合素、細胞骨架與黏著斑、漿膜結構、鈣黏蛋白和其他細胞間連接均屬于細胞中含有的應力感受器[37]。整合素可經跨膜結構，在細胞外基質上黏附細胞，促進胞質和細胞外環(huán)境的溝通；細胞骨架是細胞特有的信號感應與傳導的感受器，黏著斑是連接細胞外基質和細胞骨架的橋梁，通過連接F-肌動蛋白，來向細胞內傳遞應力信號，激活信號分子級聯(lián)酶促反應，二者可對外界應力刺激作出反應，進行信號傳導。除此之外，跨膜蛋白、脂質和胞膜窖同樣能感受到應力刺激，對細胞信號傳導予以介導；鈣黏蛋白是重要的細胞應力感受器，可對細胞信號傳導進行介導，是β-連環(huán)蛋白傳導入核的上游分子。需要注意的是，離子纖維毛、初級纖毛、縫隙連接同樣在牽張應力信號傳導中發(fā)揮著各自的作用。

外界應力刺激在細胞應力感受器的介導下，改變細胞內分子信號，其應力轉導方式包括調控蛋白核向轉運、蛋白酶級聯(lián)反應、第二信使系統(tǒng)和F蛋白調節(jié)信號[38]。GTP激酶可與水解鳥嘌呤三磷酸特異性結合，對細胞代謝過程予以調控；張應力經G蛋白偶聯(lián)受體激活GTP,促進細胞質內環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷和鈣的上調。平滑肌細胞、成纖維細胞和骨髓間充質干細胞中的GTP激酶在牽張應力下被激活。蛋白激酶包括絲裂原激活蛋白激酶、黏著斑激酶和Src激酶，絲裂原激活蛋白激酶可對細胞分化、增殖、遷移和凋亡發(fā)揮調控作用，在信號介導與傳遞環(huán)節(jié)中，經級聯(lián)激酶的酶促生化反應是通過依次激活MKKK、MKK和絲裂原激活蛋白激酶的方式實現(xiàn)的。黏著斑激酶在黏著斑周圍聚集，可對生長因子進行調節(jié)，也能傳遞外界應力信號，與樁蛋白等多種信號分子存在聯(lián)系，進而激活包括絲裂原激活蛋白激酶在內的許多信號通路。通常情況下，應力加載后骨細胞中鈣離子改變最先被檢測到，細胞胞質內鈣離子在牽張應力下募集，鈣離子表達的改變與IP3、NO和ATP等信號通路密切相關。細胞內鈣離子募集可激活蛋白酶A、c-fos基因和絲裂原激活蛋白激酶等多種下游通路。前列腺素E3在應力成骨下的作用不容忽視，其激活以鈣離子調控為基礎。雌激素受體可以應力下成骨活動進行調控，去除雌激素受體的小鼠，對應力反應的靈敏性遠不及野生小鼠；同樣，加載應力后，雌激素受體被去除的小鼠，其轉錄調控低于野生小鼠。它是通過基因組和非基因組來對骨細胞牽張應力反應進行調控的[39]。

4 牽張成骨中骨髓充質間干細胞遷移研究

多向分化潛能是骨髓充質間干細胞重要特征之一，它指的是在條件滿足的前提下，經誘導分化為骨、軟骨和肌肉等不同組織細胞，它是組織工程和再生醫(yī)學中的研究重點[40]。

生理條件下，骨髓充質間干細胞保持靜息狀態(tài)，為骨髓中間充質干細胞龕控制，而不是在組織中游離。一般來講，間充質干細胞在組織器官特定微環(huán)境中存在，該環(huán)境可對間充質干細胞自我更新能力起到明顯的維持作用，也可對該細胞大量分化予以防范。間充質干細胞龕以間充質干細胞、整合素、血管內皮細胞和細胞外基質為微環(huán)境的主要成分，多位于成骨細胞或是血管周圍，骨髓充質間干細胞多依附血管存在，屬于血管中細胞亞群。

創(chuàng)傷等病理條件和應力等外界刺激可使骨組織中的骨髓間充質干細胞處于動態(tài)，在外界刺激下，骨髓間充質干細胞自干細胞龕脫離，遷移至成骨前線，分化后形成成骨細胞，使得新生骨質沉積，對受損骨組織予以修復[41]。應力主要通過擾動、影響細胞外基質剛度和改變細胞剛性三種形式在干細胞龕中骨髓間充質干細胞上發(fā)揮作用，滿足三種條件中的任何一項，便可導致骨髓間充質干細胞脫龕。由此可以看出，骨髓間充質干細胞生物學效能的發(fā)揮以細胞脫龕后遷移至成骨部位為前提牽張應力下的牽張成骨過程同樣如此。

牽張成骨需要實現(xiàn)骨質降解和新骨再生的動態(tài)平衡?；|金屬蛋白酶可對骨細胞外基質發(fā)揮降解作用，在牽張成骨中起著重要作用。此外，細胞遷移同樣少不了基質金屬蛋白酶，主要是因為該過程中存在細胞外基質降解，基質金屬蛋白酶可調控牽張應力下間充質干細胞的生物學行為[42]。

YANG等[43]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞存在血管周圍的干細胞龕，血管周圍為血管基底膜環(huán)繞，為骨髓間充質干細胞維持在血管周圍創(chuàng)造了一個合適的微環(huán)境。血管基底膜以明膠、ⅣX型膠原和層黏連大蛋白為主要成分?；|金屬蛋白酶2可對血管基底膜起到降解作用，促進骨髓間充質干細胞脫龕與遷移。

5 小結

綜上所述，盡管自有研究提出牽張成骨的“張力拉力法則”及相關應用原則以來，牽張成骨技術在臨床上應用提升明顯。然而，牽張成骨治療周期長，可能出現(xiàn)成骨不全等一系列不足如今已極大限制了其進一步的提高。正因如此，研究該技術相關分子機制尤其是骨髓間充質干細胞在牽張成骨中遷移調控機制，在突破其臨床應用發(fā)揮著重要作用。相信隨著醫(yī)療技術水平的不斷發(fā)展和相關工作者對牽張成骨技術研究的不斷深入，將完全揭示牽張成骨中干細胞遷移與調控機制，并在此基礎上促進牽張成骨臨床效能的提升。