無乳鏈球菌分子流行病學(xué)研究進展

趙 晶，劉靜嫻，劉 瑛

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），20世紀30年代由Rebecca Lancefield分離自患牛乳腺炎的奶牛而得名，因其具有蘭氏B組抗原，又稱被稱為B族鏈球菌（Group BStreptococcus）。《伯杰氏細菌鑒定手冊》將其描述為革蘭染色陽性、觸酶陰性的兼性厭氧菌，呈球形或卵圓形，直徑小于2 μm。B族鏈球菌可在健康女性的生殖道和消化道中定植，青春期以后的女性檢出率較高，在孕婦中可以達到17%～19%[1]。定植于孕產(chǎn)婦生殖道B族鏈球菌，可導(dǎo)致圍產(chǎn)期嬰兒感染，成為引起產(chǎn)褥期肺炎、膿毒血癥和腦膜炎等侵襲性新生兒疾病的主要危險因素[2]。嬰兒出生后7 d內(nèi)發(fā)生的早發(fā)型感染（early onset disease，EOD）常伴發(fā)肺炎，1周后至3個月發(fā)生的遲發(fā)型感染（late onset disease，LOD）通常與膿毒血癥和腦膜炎相關(guān)。大于3月齡的嬰兒亦可被B族鏈球菌感染，稱為超遲發(fā)型感染（long late onset disease，LLOD）。此外，B族鏈球菌還是產(chǎn)后感染和患有糖尿病、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、腫瘤等特定人群機會性感染的重要病原體，可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎等[3]。自1938年首例致死性產(chǎn)后感染病例被報道，到上世紀70年代以來，B族鏈球菌已成為新生兒敗血癥和腦膜炎的主要病原體。在產(chǎn)前篩查聯(lián)合預(yù)防性使用抗生素（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）策略實施之前，它是造成發(fā)達國家新生兒死亡的頭號感染因素。得益于IAP的廣泛實施，近年EOD-B族鏈球菌感染率已顯著下降，然而LOD患病率并沒有明顯變化，LOD-B族鏈球菌感染仍是新生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一[4]。綜上，了解全球B族鏈球菌在人群尤其是孕產(chǎn)婦體內(nèi)定植和新生兒疾病中的分子流行病學(xué)特征以及分子流行病學(xué)分析方法十分重要。

1 B族鏈球菌分型和分子流行病學(xué)特征

1.1 莢膜血清型（capsular polysaccharide serotype，CPS）

B族鏈球菌菌體外包裹著一層莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP），由CP決定的血清型稱為CPS。根據(jù)B族鏈球菌CP的免疫反應(yīng)性，目前已鑒定出10種血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ）和不可分型（nontypeable，NT）。CPS可以通過膠乳凝集法和多重PCR等分子生物學(xué)方法檢測來鑒定。研究中常利用CPS將B族鏈球菌分離株分成血清學(xué)上相似的群體，以了解該菌在懷孕和非懷孕成人體內(nèi)定植以及新生兒疾病中的流行情況。B族鏈球菌最常見的莢膜CPS包括Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，占全球血清型的98%[1]。然而，在世界各大洲之間，聯(lián)合國定義的發(fā)達國家和非發(fā)達國家之間，不同血清型的流行率存在著差異（見表1）[5-26]。

表1 無乳鏈球菌莢膜血清型全球流行分布及特點

1.2 多位點序列分型（MLST）

近年來，隨著新的核酸檢測技術(shù)出現(xiàn)，B族鏈球菌基因編碼信息不斷被破譯，其分子流行病學(xué)研究得到了新的發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)，編碼CPS的基因組，其包含的基因信息與特定的血清型并不完全一致。2003年，Jones等[27]利用7個已知的管家基因（adhP、atr、glcK、glnA、pheS、sdhA和tkt）建立了B族鏈球菌的MLST方法。隨后Jolley等[28]創(chuàng)立了MLST數(shù)據(jù)庫，該庫現(xiàn)已收錄4 000多個B族鏈球菌分離株信息。數(shù)據(jù)庫顯示目前全球主要流行的ST型包括ST-17（20.4%）、ST-1（13.6%）、ST-23（12.6%）、ST-19（7.9%）、ST-10（6.6%）[26]。

CPS與MLST序列類型（ST）有一定相關(guān)性，但并不是嚴格對應(yīng)，具有相同ST的B族鏈球菌菌株可能有不同的血清型。數(shù)個ST可組成克隆復(fù)合體（clonal complexes，CC），同 一CC的ST成 員包含的上述7個管家基因中最多僅允許1個等位基因發(fā)生變異。CC的編號根據(jù)其祖系ST型或主要ST型確定。從人體分離的B族鏈球菌主要CC包括CC-17、CC-1、CC-23、CC-19、CC-10等[4]。從MLST全球數(shù)據(jù)庫中可以得知各大洲B族鏈球菌分離株數(shù)據(jù)的分布差異，其中來自歐洲數(shù)據(jù)的占39.1%，非洲28.5%，亞洲13.4%，北美洲11.9%，南美洲0.1%，大洋洲數(shù)據(jù)缺少，而荷蘭、肯尼亞、日本、美國、巴西分別提交了所屬洲最多的數(shù)據(jù)[26]。需要指出的是，數(shù)據(jù)量占比并不代表其實際流行分布，主要與該地區(qū)的數(shù)據(jù)提交量有關(guān)。

從MLST數(shù)據(jù)庫可以看到ST和CPS之間的某些關(guān)聯(lián)性，每個最流行的ST及其所屬的CC似乎都與某些特定的血清型相關(guān)，致病性亦有其相對獨特的表現(xiàn)（見表2）。CC-17組的血清型同質(zhì)性明顯，除一小部分未明確的血清型外，所有分離株均關(guān)聯(lián)CPS Ⅲ[26]。有研究指出，導(dǎo)致侵襲性新生兒感染的主要克隆株多屬于Ⅲ型，且主要來自CC-17，占LOD-B族鏈球菌感染的80%以上[4]。前述我國臺灣地區(qū)的研究中，ST-17占B族鏈球菌嬰幼兒侵襲性疾病的56.6%，其中87.3%的ST-17為血清Ⅲ型[12]。CC-17以外的克隆株更多見于成人侵襲性感染。ST-12和CPS Ⅰb之間的相關(guān)性密切，而除了ST-17外其他所有ST中都發(fā)現(xiàn)有CPS Ⅴ菌株[29]。美國和加拿大的一項研究發(fā)現(xiàn)，CC-1組中的ST-1與CPS Ⅴ之間存在顯著的相關(guān)性，而非妊娠期成人的侵襲性B族鏈球菌感染由Ⅴ型引起的占了相當(dāng)大比重。該研究中的Ⅴ型分離株中ST-1占92%，非ST-1菌株最主要為ST-19。作者認為ST-1菌株的出現(xiàn)是20世紀90年代以來成人B族鏈球菌侵襲性感染的主要原因[30]。分離自人體的ST-1被認為可能與分離自牛的B族鏈球菌 ST-1型同源，全基因組測序確認了1992年的ST-1克隆株與20世紀70年代導(dǎo)致奶牛乳腺炎的瑞典菌株密切相關(guān)[4,30]。除此之外，部分B族鏈球菌克隆株還與定植有相關(guān)。前述Jones等[27]發(fā)現(xiàn)ST-19和部分ST-1與無癥狀定植顯著相關(guān)，而ST-23在定植和侵襲性感染中均常見。來自加拿大的一項研究同樣得出了類似的結(jié)論，認為ST-1和ST-23是孕婦中最常見的定植株[31]。而在非洲東北部，從孕婦陰道、直腸和新生兒體表分離的定植株主要克隆復(fù)合體為CC-10，占68.8%，其中ST-10最常見占37.5%[32]。綜上所述，利用MLST分析B族鏈球菌的分子流行病學(xué)特征是近期的研究熱點，這項技術(shù)的應(yīng)用為我們提供了從血清型基因方面了解B族鏈球菌流行特點的新的角度。

表2 部分無乳鏈球菌MLST分型與莢膜血清型相關(guān)性

2 分子流行病學(xué)檢測方法

2.1 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE是另一種分析B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征的分子生物學(xué)方法，在評估菌株遺傳親緣關(guān)系方面具有高區(qū)分度的特殊優(yōu)勢。有研究應(yīng)用PFGE方法發(fā)現(xiàn)，血清Ⅰb、Ⅲ和Ⅴ型菌株具有同源性，而血清Ⅳ、Ⅰa和Ⅱ型菌株則不具有同源性[33]。這表明經(jīng)典的CPS分析無法全面地揭示B族鏈球菌菌株之間遺傳關(guān)系的遠近。雖然使用PFGE可以觀察到比傳統(tǒng)血清學(xué)分型更為深入的菌株親緣關(guān)系，但該技術(shù)也有其局限性。由于缺乏統(tǒng)一的命名分型系統(tǒng)，加之鑒定凝膠上的片段條帶具有主觀性，在報告條帶大小時缺乏客觀標準，PFGE分析很難在不同研究之間進行比較[26]。目前，該法多用于分析一項研究中來源不同的菌株及其傳播方式之間的差異。例如，有項早期的研究觀察到來自母體和其分娩兒的B族鏈球菌分離株具有相同的片段圖譜模式，從而明確了該型菌株的母嬰垂直傳播[34]。從另一方面看，拋開其局限性，PFGE法揭示了B族鏈球菌菌株血清型內(nèi)和血清型間存在的遺傳變異，提供了從另一個角度研究B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征的工具，促進了新的發(fā)展。

2.2 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA）

MLVA原理與MLST相似，但該法利用的不是管家基因，而是VNTR（variable-number tandem-repeat）基因座。VNTR由遍布于整個細菌基因組不同基因位點的DNA的重復(fù)序列組成。不同菌株VNTR基因座的重復(fù)序列數(shù)量不盡相同，因此可以類似MLST，將幾個VNTR基因座組合起來進行綜合分析，從而產(chǎn)生不同菌株的VNTR特征性圖譜。應(yīng)用MLVA可以對多種細菌進行新的分型。Radtke等[35]研究了B族鏈球菌基因組5個最具多樣性的基因座（SATR1、SATR2、SATR3、SATR4和SATR5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLVA分型與CPS分型或MLST分型大體相符，但前者區(qū)分度更高。該研究中總共126株B族鏈球菌實驗分離株具有70種不同的MLVA類型（MT），而只有36種MLST的ST型和19種CPS。同時該研究還顯示，SATR2的重復(fù)序列與CPS Ⅸ型相對應(yīng)，SATR3與ST-17密切相關(guān)，SATR5則與CPS Ⅴ/ST-1有一定相關(guān)性。SATR1基因座被認為是由成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered

regularly interspaced short palimdromic repeats，

CRISPR）組成的，其在MLVA分析中的作用尤為特殊和重要。

也有人僅使用6個VNTR基因座進行分析，包括上述Radtke等[35]研究的3個，同樣顯示了MLVA的98種 分 型 相 比MLST的51種 分 型 具有更大的區(qū)分力。該研究還發(fā)現(xiàn)，MLVA MT與MLST CC有相似之處，所有人體分離株CC-17均出現(xiàn)在MT-9群中。同時該研究還將MLST CC-23分成了CPSⅢ和CPS Ⅰa兩群，再一次體現(xiàn)了MLVA的高區(qū)分度[36]。巴西一項研究對育齡非孕婦定植的B族鏈球菌利用MLVA進行基因分型，總共86株分離株中發(fā)現(xiàn)了15種MT[37]。另一項關(guān)于孕婦的研究中41株B族鏈球菌分離株中發(fā)現(xiàn)30株MT，同樣顯示了MLVA分型高度多樣性的流行特征[38]。然而，與PFGE類似，因為沒有統(tǒng)一命名標準的數(shù)據(jù)庫，該分型方法同樣很難在研究之間進行比較。但是MLVA分析顯示出了高度區(qū)分力、高度多樣性的B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征，這一新技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用值得進一步關(guān)注。

2.3 CRISPR

CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)核苷酸序列，在生物進化史上，細菌為了將病毒、噬菌體的外來入侵基因清除，進化出了CRISPR-Cas系統(tǒng)。CRISPR和Cas（CRISPR相關(guān)蛋白）在細菌主動性防御和適應(yīng)性免疫中起到重要作用。該系統(tǒng)保守而特殊的回文樣基因排列及其變異，保留了細菌久遠進化史上各個時期基因入侵的痕跡。上文提及的MLVA SATR1基因座即被認為是由CRISPR組成。在B族鏈球菌中，已經(jīng)確定了兩個CRISPR-Cas系統(tǒng)，包括普遍存在且有功能的II-A型系統(tǒng)和罕見且常不完整的I-C型系統(tǒng)，分別與CRIPSR locus 1 （CRISPR 1）和CRISPR 2相對應(yīng)[39]。CRISPR1廣泛存在于細菌基因組，使其成為追蹤基因變異的一個非常重要的分子標記。利用這種方法，法國的一項研究能夠在11年的時間里追蹤監(jiān)測100名女性的陰道B族鏈球菌定植演變情況[40]。另一項同樣來自法國的研究則揭示了2群共存于孕婦體內(nèi)的B族鏈球菌定植菌株群親緣相近，可能來自同一祖先[41]。CRIPSR 1作為一種新的基因標志物，其記錄了細菌隨著時間演變形成的更為細致而又多樣性的分子流行特征和流行趨勢，成為了近年來的研究熱點。

3 總結(jié)

本文綜合闡述了目前全球無乳鏈球菌的分子流行病學(xué)特征，以及一些新的分子流行病學(xué)分析方法的研究應(yīng)用。傳統(tǒng)的CPS分型及其分布目前在全球研究得最為廣泛和深入，其取得的大量數(shù)據(jù)，顯示出了相對清晰的經(jīng)典分子流行趨勢。MLST是目前研究較多的技術(shù)領(lǐng)域，其描述的分子特征相對CPS更具多樣性并有其自身的流行規(guī)律，提供了從基因?qū)用媪私釨族鏈球菌流行特點的新角度。PFGE可用于分析分子特征相近菌株之間的遺傳親緣關(guān)系，在單項研究內(nèi)了解血清型內(nèi)和血清型間細微的遺傳變異方面有其獨特的優(yōu)勢。MLVA具有高區(qū)分度特點，其描述的細菌分子特征展現(xiàn)了B族鏈球菌更為復(fù)雜多樣化的流行結(jié)構(gòu)。CRISPR系統(tǒng)特有代代相傳的基因入侵印跡，能讓我們更為深入細致地了解菌株之間的遺傳同源性。本文關(guān)于這些分子流行病學(xué)特征及研究進展的初步探討，旨在為防治B族鏈球菌侵襲性疾病提供重要的流行病學(xué)資料，為血清型相關(guān)的疫苗研發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)，為早期干預(yù)治療母嬰B族鏈球菌感染，減少母嬰間垂直傳播提供有價值的信息。全球各國學(xué)者對于B族鏈球菌分子流行病學(xué)的研究正在不斷深入，前景值得期待。