癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)中差異表達(dá)基因生物信息分析

彭金香，吳 灃

癲癇是最常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是一種復(fù)雜性疾病，主要原因?yàn)檫z傳因素和環(huán)境因素(如癲癇家族史、神經(jīng)性合并癥、早產(chǎn)、母親酗酒、妊娠期吸煙等)[1]。我國(guó)癲癇患病率為0.68%，近1 000萬(wàn)名癲癇病人中有20%～30%為藥物難治性癲癇[2]。尋找候選生物標(biāo)志物及致病機(jī)制對(duì)于癲癇的早期診斷和有效治療極為重要。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是尋找癲癇候選生物標(biāo)志物及致病機(jī)制的有效方法之一。一些學(xué)者針對(duì)癲癇發(fā)作開(kāi)展了一系列轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[3-8]。本研究通過(guò)提取基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用GE02R、DAVID及STRING等分析平臺(tái)對(duì)癲癇發(fā)作新皮質(zhì)中的相關(guān)差異表達(dá)基因(DEGs)及信號(hào)通路進(jìn)行分析，探討新皮質(zhì)在癲癇發(fā)作中所發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)及分組 以“epilepsy”作為搜索詞，進(jìn)入美國(guó)國(guó)立生物中心的 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中搜索已公布的epilepsy基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取一個(gè)來(lái)自日本群馬大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院的數(shù)據(jù)集GSE6388。該數(shù)據(jù)集包含6只尼古丁誘導(dǎo)癲癇發(fā)作小鼠的新皮質(zhì)及6只對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)，所有小鼠均采用Affymetrix Murine Genome U74A Version 2 Array芯片分析大腦新皮質(zhì)的基因表達(dá)譜。本研究選取該數(shù)據(jù)集中尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組及對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)組。通過(guò)將尼古丁誘導(dǎo)癲癇發(fā)作小鼠的新皮質(zhì)組及對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)組進(jìn)行比較以獲取DEGs。

1.2 DEGs的篩選及分析 采用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GE02R芯片分析平臺(tái)對(duì)6只尼古丁誘導(dǎo)癲癇發(fā)作小鼠的新皮質(zhì)及6只對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并用貝葉斯分析法對(duì)出生后第30天癲癇發(fā)作小鼠的新皮質(zhì)中DEGs進(jìn)行篩選。差異基因篩選條件為P<0.05且logFC>1。利用DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)分析平臺(tái)[9]對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(GO)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)信號(hào)通路分析。

1.3 候選基因直接與癲癇致病性的基因相互作用 選取尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組差異基因和癲癇致病性的基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，最后利用STRING11.0(https://string-db.org/)分析平臺(tái)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，分析結(jié)果采用cytoscape 3.7.1軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并利用BiNGO模塊分析相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程[10]。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 與對(duì)照組比較，出生后第30天尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組共篩選出214個(gè)DEGs，其中95個(gè)上調(diào)基因及119個(gè)下調(diào)基因，前10個(gè)上調(diào)基因及下調(diào)基因見(jiàn)表1、表2。

表1 尼古丁誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組中前10個(gè)上調(diào)基因

表2 尼古丁誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組中前10個(gè)下調(diào)基因

2.2 GO分析和KEGG信號(hào)通路分析 將尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組和對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)組DEGs進(jìn)行GO分析(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因細(xì)胞組分顯示，主要定位于核染色體、核小體、細(xì)胞間黏附連接、染色質(zhì)等。生物學(xué)過(guò)程顯示，主要集中在基因沉默、胞嘧啶上的DNA甲基化、DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝等方面；分子功能顯示，主要為核小體DNA結(jié)合、鈣黏附素參與細(xì)胞黏附等(見(jiàn)表3)；對(duì)低表達(dá)的基因細(xì)胞組分顯示，主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜外、血微粒、次級(jí)內(nèi)體等。生物學(xué)過(guò)程顯示，主要集中在細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等方面；分子功能顯示，主要為DNA結(jié)合等方面(見(jiàn)表4)。

表3 尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組和對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)組DEGs的GO分析

表4 尼古丁誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)中基因低表達(dá)的GO分析

將尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)組和對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)組DEGs進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示，對(duì)高表達(dá)的基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、刺激神經(jīng)組織的配體受體相互作用通路(見(jiàn)表5)；低表達(dá)的DEGs主要富集在核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(見(jiàn)表6)。

表5 尼古丁誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)中基因高表達(dá)信號(hào)通路分析

表6 尼古丁誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)中基因低表達(dá)信號(hào)通路分析

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 從Nature雜志子刊Genetics in Medicine中檢索癲癇致病性基因[11]。將尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)214個(gè)DEGs及癲癇致病性的27個(gè)基因?qū)隨TRING平臺(tái)并分析構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到228個(gè)節(jié)點(diǎn)、399條關(guān)系。將上述蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape 3.7.1軟件中，結(jié)果顯示37個(gè)DEGs與癲癇明確致病性基因有相互作用，分別是Vsx2、Vegfc、Try5、Try4、Tnfaip3、Tlk2、Spta1、Slc38a2、Sfn、Rps26、Rpl38、Rgs9、Ptpn5、Pnpo、Pax3、Neurog1、Map2k1、Lhx8、Lepr、Klf4、Kifap3、Kcnmb1、Kcna5、Huwe1、Eif5a、Egfr、Cd3d、Calca、Braf、Bcl2l11、Gns、Irf1、Sall4、Dntt、Pign、Decr1、Ldhb。與癲癇致病性基因節(jié)點(diǎn)最多的6個(gè)DEGs分別是Spta1、Rps26、Ptpn5、Pnpo、Huwe1、Egfr，DEGs所編碼的蛋白與其他蛋白存在廣泛的相互作用(見(jiàn)圖1)。通過(guò)cytoscape 3.7.1軟件的BiNGO模塊分析該相互作用網(wǎng)絡(luò)，提示其與細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控、肌動(dòng)蛋白絲聚合的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。

圖1 癲癇致病性基因與27個(gè)DEGs的網(wǎng)絡(luò)相互作用

3 討 論

本研究利用已報(bào)道的GEO芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，并通過(guò)提取該數(shù)據(jù)集中6只尼古丁誘導(dǎo)癲癇發(fā)作小鼠的新皮質(zhì)及6只對(duì)照健康小鼠的新皮質(zhì)基因表達(dá)譜。分析尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)差異基因。本研究成功篩選出的214個(gè)差異基因，其中95個(gè)上調(diào)基因及119個(gè)下調(diào)基因。DEGs細(xì)胞組分顯示，主要定位于核染色體、核小體、細(xì)胞間黏附連接、染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜外、血微粒、次級(jí)內(nèi)體等。生物學(xué)過(guò)程顯示，主要集中在基因沉默、胞嘧啶上的DNA甲基化、DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝、細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等方面。分子功能顯示，主要為核小體DNA結(jié)合，鈣黏附素參與細(xì)胞黏附、DNA結(jié)合等方面。對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果提示DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、刺激神經(jīng)組織的配體受體相互作用通路、NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路。

通過(guò)尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)214個(gè)DEGs與癲癇致病性基因構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有228個(gè)節(jié)點(diǎn)、399條關(guān)系，最終有37個(gè)DEGs與癲癇明確致病性基因有相互作用，其中與癲癇致病性基因節(jié)點(diǎn)最多的6個(gè)DEGs分別是Spta1、Rps26、Ptpn5、Pnpo、Huwe1、Egfr，并提示其與細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控、肌動(dòng)蛋白絲聚合的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。對(duì)這些基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，其中Pnpo、Egfr與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，ErbB1)屬于受體酪氨酸激酶家族，酪氨酸激酶是胚胎和腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。使用EGFR基因敲除小鼠和缺乏EGFR小鼠，通過(guò)兩種不同的Cre系(Nestin-Cre和GFAP-Cre)來(lái)闡明EGFR在大腦中的功能。缺乏EGFR小鼠會(huì)在出生后早期出現(xiàn)額葉皮層和嗅球變性，并顯示皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增加。EGFR基因敲除小鼠的不良健康狀況和早期致死性阻止了成年大腦中EGFR神經(jīng)變性。盡管條件等位基因進(jìn)行了基因重組，但與EGFR基因敲除小鼠相比，大腦中缺乏EGFR的小鼠顯示出較低的皮層變性穿透性。成年大腦中缺乏EGFR小鼠建立了適當(dāng)?shù)难X屏障，并對(duì)機(jī)械性和感染性腦損傷做出反應(yīng)性星形膠質(zhì)變，但對(duì)海因酸引起的癲癇發(fā)作更敏感。缺乏EGFR的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(而非中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glt1和Glast的表達(dá)降低。

癲癇可由腦內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡和神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性引起[14-18]。VEGF-C和VEGFR-3在多種疾病中上調(diào)，包括心肌梗死、自身免疫性腦脊髓炎、缺血性中風(fēng)和癲癇[19-21]。Cho等[22]研究了毛果蕓香堿誘導(dǎo)C57BL/6N小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)的VEGF-C和其受體VEGFR-3的時(shí)空表達(dá)。小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)1 d后，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)4 d后觀察到金字塔形神經(jīng)元死亡。在錐體束下層區(qū)域，VEGF-C表達(dá)在小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)7 d后逐漸增加并達(dá)到峰值，而VEGFR-3在小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)4 d后明顯上調(diào)，并在癲癇持續(xù)狀態(tài)7 d后開(kāi)始下降。多數(shù)表達(dá)VEGF-C/VEGFR-3的細(xì)胞是錐體神經(jīng)元。但是，在小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)4 d和7 d后，VEGFR-3和VEGF-C的免疫反應(yīng)性主要發(fā)生在星形膠質(zhì)細(xì)胞中以及在放射狀層的某些小膠質(zhì)細(xì)胞和海馬的腔隙小分子中。這些數(shù)據(jù)表明，毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)上調(diào)。

顳葉癲癇是成人局灶性頑固性癲癇的常見(jiàn)形式。為了確定VEGF-C及其受體是否參與顳葉癲癇的發(fā)生，Sun等[23]研究了28例顳葉癲癇病人和10例對(duì)照病人在顳新皮層和海馬中VEGF-C及其受體的水平和表達(dá)模式，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，顳葉癲癇組VEGF-C、VEGFR-2和VEGFR-3的mRNA和免疫反應(yīng)蛋白水平上調(diào)。VEGF-C在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(包括反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)中高表達(dá)，VEGFR-2在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，在神經(jīng)元中不表達(dá)，而VEGFR-3僅在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。

本研究首次應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)尼古丁誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的新皮質(zhì)中相關(guān)基因進(jìn)行分析，上述研究結(jié)果證實(shí)了部分關(guān)鍵基因在癲癇病理生理等方面的作用，但關(guān)于Spta1、Rps26、Ptpn5、Huwe1基因在癲癇中作用的報(bào)道較少，仍需要對(duì)這些相關(guān)基因進(jìn)一步深入研究。