陳偉忠
廣東省潮州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東潮州 521000
瘧疾是由瘧原蟲(chóng)造成的一種全球性急性寄生蟲(chóng)傳染病[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),2018年全球發(fā)生了2.28億例瘧疾病例,其中以非洲的撒哈拉以南地區(qū)感染瘧疾的疫情最重[3]。青蒿素是我國(guó)科學(xué)家從青蒿中發(fā)現(xiàn)的新型抗瘧藥物。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACT)被廣泛用于瘧疾臨床治療,成為治療瘧疾的一線(xiàn)藥物[4-5]。近年來(lái),惡性瘧原蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)了青蒿素抵抗的現(xiàn)象。目前的研究表明,惡性瘧原蟲(chóng)第13號(hào)染色體上編碼的kelch蛋白的基因,即K13基因,其螺旋槳域N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H和C580Y氨基酸替換能夠影響原蟲(chóng)體外存活率和體內(nèi)清除率,該基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以作為監(jiān)控ACT藥物抗性的分子標(biāo)記[6]。特別是在東南亞地區(qū)C580Y被認(rèn)為是一種主要和富有潛力的衡量青蒿素抵抗的分子標(biāo)志。通過(guò)對(duì)這些惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素耐藥相關(guān)基因突變的檢測(cè),可以評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)耐藥性情況[7]。
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的非標(biāo)記探針?lè)ǜ叻直嫒劢馇€(xiàn)(HRM)分析技術(shù),不僅可以確定特定等位基因的存在或缺失,還可以檢查探針下的整個(gè)區(qū)域單個(gè)堿基差異[8]。該分析方法的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和特異度極高;所有實(shí)驗(yàn)反應(yīng)試劑均在實(shí)驗(yàn)前加入管中,以避免開(kāi)蓋造成的實(shí)驗(yàn)污染;其檢測(cè)通量大而成本低,適合臨床大批量標(biāo)本的篩查[9]。
1.1一般資料 通過(guò)設(shè)計(jì)的目的基因突變位點(diǎn)的探針和引物,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,使用HRM非標(biāo)記探針基因分型技術(shù)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素耐藥性相關(guān)K13基因C580Y突變位點(diǎn)。
1.2儀器與試劑 Thermo Cell恒溫金屬浴、薄壁管低俗離心機(jī)、BIOER基因擴(kuò)增儀、LightScanner高分辨溶解曲線(xiàn)分析儀;干血斑基因組DNA提取試劑盒(DP334)、2×Taq plus PCR MasterMix、飽和熒光染料LC Green、96孔全裙邊板HSP9665、0.2 mL薄壁管PCR-02-C。
1.3方法
1.3.1設(shè)計(jì)探針與引物 引物和探針設(shè)計(jì)后由上海美吉醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司合成,產(chǎn)品真空冷凍干燥保存。探針序列:TCATCATCTATGTGTGTTGCTTT-block;上游引物序列:GCTCTTCTATTATACCGAA;下游引物序列:TTCTAATAAGGCATATGGAA。產(chǎn)物長(zhǎng)度為218 bp。
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 采用人工合成的辦法由華大公司合成含有青蒿素耐藥相關(guān)突變C580Y和野生型的pUC57-amp質(zhì)粒。
1.3.3PCR反應(yīng)體系 本實(shí)驗(yàn)采用不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增法,上、下游引物比為5∶1。反應(yīng)體系為20 μL,試劑配制及用量如下:2.0 μL(約20 ng)基因組DNA或103 copy/mL質(zhì)粒(對(duì)照)、0.2 μL 10.0 μmol/L上游引物、1.0 μL 10.0 μmol/L的下游引物、10.0 μL 2×Master Mix(艾德萊公司)、0.5 μL 10.0 μmol/L非標(biāo)記探針(3′端采用C3 spacer或磷酸化封閉)、2.0 μL飽和熒光染料LC Green,最后加無(wú)菌蒸餾水至20.0 μL。進(jìn)行反應(yīng)前加入礦物油10 μL,以防止揮發(fā)污染。突變型和野生型標(biāo)本分別進(jìn)行5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.4PCR擴(kuò)增與HRM檢測(cè) 將反應(yīng)體系加入96孔全裙邊板,放至BIOER基因擴(kuò)增儀,PCR 程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min,然后94 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s,進(jìn)行55 個(gè)循環(huán),95 ℃ 1 min,使異源雙鏈核酸分子形成。15 ℃保持直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
擴(kuò)增完畢后,將96孔全裙邊板放至微孔板專(zhuān)用離心機(jī)進(jìn)行離心,將產(chǎn)物聚集于反應(yīng)孔底部。產(chǎn)物通過(guò)Lightsanner96儀器檢測(cè)分析,設(shè)置起始溫度為45 ℃,結(jié)束溫度為95 ℃,儀器采集熒光信號(hào)并繪制溶解曲線(xiàn)圖進(jìn)行分析。
1.3.5靈敏度檢驗(yàn) 為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)靈敏度,同時(shí)評(píng)估該方法在野生型和突變型混合感染中突變檢測(cè)能力,筆者對(duì)突變型和野生型質(zhì)粒(10~105ng/μL)按不同比例混合稀釋。突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒原倍濃度均為1 105 copy/L,按照突變型/野生型質(zhì)粒比例為10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10進(jìn)行混合,然后分別對(duì)混合標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)混合比例進(jìn)行5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2.1HRM檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)Lightsanner96儀器對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析形成熔解曲線(xiàn)圖。在60~85 ℃形成兩個(gè)熔解曲線(xiàn)峰,即在低溫區(qū)(61~69 ℃)的探針?lè)搴透邷貐^(qū)(75~84 ℃)的產(chǎn)物峰。在探針?lè)迳?,突變型和野生型之間的溫度差達(dá)到5 ℃,能夠很好地鑒別區(qū)分,見(jiàn)圖1。
注:A為熔解曲線(xiàn)圖;B為差異曲線(xiàn)圖;C為標(biāo)化熔解峰圖。
2.2靈敏度檢驗(yàn)結(jié)果 將突變型和野生型質(zhì)粒按照比例為10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10進(jìn)行混合后再檢驗(yàn)得到的熔解曲線(xiàn),見(jiàn)圖2。各個(gè)混合比例曲線(xiàn)按比例遞進(jìn)順序依次排列,均能很好地區(qū)分,形成單一的擴(kuò)增峰,無(wú)非特異性產(chǎn)物干擾峰形成。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性、擴(kuò)增效率及良好的線(xiàn)性關(guān)系,可做基因分型的半定量檢測(cè)。
注:A為熔解曲線(xiàn)圖;B為差異曲線(xiàn)圖;C為標(biāo)化熔解峰圖。
瘧疾具有非常強(qiáng)的傳播性,其對(duì)人類(lèi)的危害不單單是局限在某一個(gè)地區(qū)或國(guó)家,而是關(guān)系到全人類(lèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題[10]。瘧原蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生和流行,更是對(duì)全球公共衛(wèi)生工作提出了巨大的挑戰(zhàn)[11]。目前,世界衛(wèi)生組織確認(rèn)性瘧原蟲(chóng)K13基因突變與青蒿素耐藥性相關(guān),可以作為惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素耐藥性的分子標(biāo)志物。根據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織關(guān)于瘧疾的ACT藥物抵抗報(bào)告,PFK13基因的F446I、N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H、C580Y這7個(gè)突變已經(jīng)被證實(shí)與青蒿素和其衍生物的抵抗有關(guān),推薦其作為監(jiān)控ACT藥物抗性的分子標(biāo)記。
目前,對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素耐藥相關(guān)基因SNP的檢測(cè)方法比較多,常見(jiàn)的有Sanger測(cè)序法[12]、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)聯(lián)合納米孔測(cè)序技術(shù)[14]及突變擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR等[15]。然而這些方法由于需要昂貴的儀器、嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境、昂貴的費(fèi)用,以及實(shí)驗(yàn)方法操作繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)等原因,限制了它們用于高瘧區(qū)大量臨床標(biāo)本的快速診斷。
HRM分析技術(shù)是一種快速而有效的基因突變檢測(cè)技術(shù),升溫過(guò)程中雙鏈DNA開(kāi)始變性解離,嵌合在其中的飽和熒光染料逐漸釋放,熒光強(qiáng)度隨著變?nèi)?。系統(tǒng)通過(guò)熒光強(qiáng)度變化與時(shí)間的關(guān)系繪制出熔解曲線(xiàn)。不同位點(diǎn)基因型會(huì)產(chǎn)生不同的熔解曲線(xiàn)峰形,因此HRM能夠有效區(qū)分。目前,臨床已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種復(fù)雜的PCR-HRM方法用于從臨床標(biāo)本中檢測(cè)瘧原蟲(chóng),但鮮見(jiàn)用于檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素耐藥性相關(guān)基因突變。
本研究基于HRM非標(biāo)記探針基因分型技術(shù),建立了針對(duì)世界衛(wèi)生組織推薦的已經(jīng)驗(yàn)證的青蒿素耐藥相關(guān)的突變C580Y的檢測(cè)方法。相對(duì)于其他分子診斷方法,此方法檢測(cè)靈敏度高,操作簡(jiǎn)便快速,成本低,反應(yīng)通量大,結(jié)果準(zhǔn)確,可以滿(mǎn)足臨床標(biāo)本的檢測(cè),并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作,減少實(shí)驗(yàn)室污染的機(jī)會(huì),是理想的檢測(cè)方法,可用于疫情地區(qū)大批量人群篩查。同時(shí),該實(shí)驗(yàn)方法可作為突變的半定量檢查,用于耐藥性瘧原蟲(chóng)水平的粗略估算,可更好地指導(dǎo)臨床用藥。研究中筆者發(fā)現(xiàn),應(yīng)用梯度PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,本實(shí)驗(yàn)上、下游引物之間5∶1的比例是最適合的;探針可被設(shè)計(jì)成與野生型或突變型互補(bǔ),探針的設(shè)計(jì)應(yīng)該將突變位點(diǎn)盡量置于中間,在應(yīng)用非標(biāo)記探針時(shí),退火溫度確定在60 ℃左右最合適,否則會(huì)產(chǎn)生非特異熔解峰而影響判讀結(jié)果。本研究將對(duì)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)優(yōu)化和改良,提高實(shí)驗(yàn)靈敏度和特異性,將該方法應(yīng)用到其他耐藥相關(guān)基因檢測(cè)中。