質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒別金線蓮產(chǎn)地

張金偉, 何聿， 邱彬， 李小晶, 張丹丹， 余文濤， 林振宇

(1. 福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建省食品安全分析與檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350108；2. 福州大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院， 福建 福州 350108; 3. 福州海關(guān)技術(shù)中心， 福建 福州 350001;4. 福州商學(xué)院， 福建 福州 350001)

0 引言

金線蓮是蘭科開唇蘭屬植物， 不耐寒， 喜溫暖濕潤， 故主要生長于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域， 如福建、 臺(tái)灣、 廣西、 云南等地[1]. 金線蓮具有“藥王”的美稱， 具有清熱解毒， 涼血除濕， 降血壓的功效[2]. 近年來， 科研工作者們利用不同檢測(cè)手段對(duì)不同產(chǎn)地金線蓮的主要成分及含量進(jìn)行了檢測(cè)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 福建金線蓮的藥用有效成分明顯高于其他產(chǎn)地金線蓮[3-7]. 這也導(dǎo)致有不法商人通過亂標(biāo)產(chǎn)地， 以次充優(yōu)來謀取暴利， 嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益. 因此很有必要建立一種不同產(chǎn)地金線蓮的快速鑒定手段.

目前中藥材成分的檢測(cè)和鑒定手段主要有氣相色譜法[8]、 液相色譜[9-10]、 氣相質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]等. 但這些方法前處理繁瑣、 耗時(shí)長、 且樣品不可回收， 而質(zhì)子傳遞反應(yīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀則可以解決以上問題.

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-飛行時(shí)間質(zhì)譜(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)是近幾年迅速發(fā)展的痕量揮發(fā)性有機(jī)物檢測(cè)技術(shù)， 由Werner Lindinger 及其課題組成員結(jié)合化學(xué)電離源技術(shù)與流動(dòng)漂移管模型技術(shù)于20世紀(jì)90年代首次提出[13]. PTR-MS具有快速、 靈敏度高、 無需樣品前處理、 操作簡單等優(yōu)點(diǎn)， 可以實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds， VOCs)的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)， 目前已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)[14]、 醫(yī)療診斷[15]、 大氣監(jiān)測(cè)[16]、 食品科學(xué)[17]等各領(lǐng)域. 2016年， Acierno V課題組[18]采用PTR-TOF-MS對(duì)不同品種、 產(chǎn)地、 品牌的巧克力進(jìn)行揮發(fā)性成分的指紋圖譜收集， 并建立數(shù)學(xué)識(shí)別模型. 2018年， Farneti課題組[19]利用PTR-TOF-MS對(duì)蘋果的香氣成分進(jìn)行了分析. Nikolaos等[20]使用PTR-MS鑒別了純正藏紅花、 摻假藏紅花以及市場(chǎng)上低質(zhì)量的藏紅花.

本研究首次將PTR-TOF-MS應(yīng)用于不同產(chǎn)地金線蓮的快速鑒定. 通過對(duì)不同產(chǎn)地金線蓮進(jìn)行香氣指紋圖譜檢測(cè)， 并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)建立數(shù)學(xué)識(shí)別模型， 以建立一種快速、 準(zhǔn)確、 便捷的金線蓮不同產(chǎn)地快速鑒定方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PTR-TOF-MS1000質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(奧地利 Ionicon 有限公司) ， Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器 (美國安捷倫科技有限公司)， EL104 型電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司) .

試驗(yàn)共收集福建金線蓮樣本26個(gè)， 廣西金線蓮樣本22個(gè)， 臺(tái)灣金線蓮樣本18個(gè). 樣品用復(fù)合鋁箔袋密封, 于25 ℃儲(chǔ)存待用.

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 條件優(yōu)化

不同頂空平衡條件影響目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值大小， 響應(yīng)值太小可能會(huì)導(dǎo)致無法檢測(cè)到部分濃度太低但具有差異性的揮發(fā)性成分. 因此在進(jìn)行數(shù)據(jù)采集之前， 需對(duì)頂空平衡時(shí)間和頂空平衡溫度進(jìn)行優(yōu)化. 選取福建金線蓮(漳州批次)主要揮發(fā)性成分中響應(yīng)值高低不同的10種物質(zhì)(質(zhì)荷比分別為33.033 5、 42.033 8、 45.033 5、 59.049 1、 75.044 1、 87.080 4、 107.048 8、 111.153 7、 137.123 1、 164.251 2 )做為參照峰進(jìn)行條件優(yōu)化.

1.2.2數(shù)據(jù)采集

首先將頂空自動(dòng)進(jìn)樣器與PTR-TOF-MS聯(lián)用. 準(zhǔn)確稱取0.3 g金線蓮樣品 (未經(jīng)過任何前處理)于10 mL頂空瓶中， 在80 ℃條件下恒溫15 min以使頂空瓶內(nèi)香氣揮發(fā)物達(dá)到平衡. 接著利用PTR-TOF-MS對(duì)金線蓮的香氣指紋圖譜進(jìn)行收集. PTR-TOF-MS儀器條件如下： 漂移管電壓640 V, 漂移管溫度80 ℃， 漂移管壓力 225 Pa, 相對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度(E/n) 140 Td, 漂移管中氣體流量40 Pa·m3·s-1, 質(zhì)荷比掃描范圍為13～500. 每個(gè)樣品以每秒一張全譜圖的采集速率測(cè)量60 s. 每個(gè)樣品獨(dú)立進(jìn)行3次試驗(yàn), 取平均值， 得到樣本平均值. 取一個(gè)空瓶, 在相同的條件下進(jìn)行檢測(cè), 進(jìn)行3次試驗(yàn)， 取平均值， 得空白平均值. 樣本平均值減去空白平均值即得到進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的PTR-TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù).

1.2.3數(shù)據(jù)分析

利用SPSS22.0軟件及Simca-p軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

通過PTR-TOF-MS檢測(cè)可以獲取不同產(chǎn)地金線蓮的揮發(fā)性成分指紋圖譜， 通過對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行數(shù)學(xué)建?？梢詫?shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地金線蓮的分類識(shí)別. 各產(chǎn)地金線蓮的PTR-TOF-MS指紋圖譜如圖1所示.

圖1 不同產(chǎn)地金線蓮的PTR-TOF-MS指紋圖譜

2.1 條件優(yōu)化2.1.1 頂空平衡溫度的優(yōu)化

固定頂空平衡時(shí)間為10 min， 頂空平衡溫度分別為25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110 ℃， 觀察各物質(zhì)響應(yīng)值的變化， 結(jié)果如圖2所示. 通過固定平衡時(shí)間， 改變頂空平衡溫度可以發(fā)現(xiàn)， 大部分揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)值在80 ℃后上升緩慢， 因此選擇頂空平衡溫度為90 ℃作為頂空平衡條件之一.

圖2 不同產(chǎn)地金線蓮主要揮發(fā)性成分響應(yīng)值隨平衡溫度的變化Fig.2 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating temperatures

2.1.2頂空平衡時(shí)間的優(yōu)化

固定頂空平衡溫度為90 ℃， 頂空平衡時(shí)間分別為0、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 min， 觀察各物質(zhì)響應(yīng)值的變化， 結(jié)果如圖3所示. 通過固定平衡溫度， 改變頂空平衡時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)， 大部分揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)值在15 min后上升緩慢， 因此選擇頂空平衡時(shí)間為15 min作為頂空平衡條件之一.

圖3 不同產(chǎn)地金線蓮主要揮發(fā)性成分響應(yīng)值隨平衡時(shí)間的變化Fig.3 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating times

2.2 快速準(zhǔn)確識(shí)別方法的確立2.2.1 主成分降維

表1為主成分分析法中前10 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率.

表1 主成分分析法中前10 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率

對(duì)于大部分的判別分析方法來說， 太多的變量數(shù)目在建立模型時(shí)容易遭遇維數(shù)災(zāi)難. 在建立數(shù)學(xué)模型前先采用主成分分析(principal components analysis, PCA)進(jìn)行降維處理. 以85%～95%為范圍， 分別選取前2個(gè)主成分， 前3個(gè)主成分， 前4個(gè)主成分， 前5個(gè)主成分， 前6個(gè)主成分包含的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)作為降維后的數(shù)據(jù)建立各種數(shù)學(xué)分類模型.

2.2.2不同數(shù)學(xué)分類模型的識(shí)別結(jié)果

采用PCA降維后的數(shù)據(jù)分別與簇類獨(dú)立軟模式法(soft independent modeling of class analogy， SIMCA)[21]、K最近鄰法(K-nearest neighbor， KNN)[22]、 偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA)[23]和費(fèi)希爾判別分析(fisher discriminant analysis， FDA)[24]等4種判別識(shí)別方法結(jié)合， 尋找一種性能最優(yōu)異的數(shù)學(xué)分類識(shí)別模型, 用來建立基于質(zhì)子傳遞反應(yīng)-飛行時(shí)間質(zhì)譜的不同產(chǎn)地金線蓮快速、 準(zhǔn)確識(shí)別方法， 結(jié)果列于表2. 總樣本數(shù)(n)均為45.

表2 不同產(chǎn)地金線蓮的分類模型識(shí)別效果

由以上結(jié)果可以看出， 不同主成分?jǐn)?shù)、 不同判別方法所建立的數(shù)學(xué)模型識(shí)別準(zhǔn)確率各不相同. 其中， 當(dāng)選取4個(gè)主成分?jǐn)?shù)， 以FDA為判別方法時(shí)建立的數(shù)學(xué)分類識(shí)別模型準(zhǔn)確率最高、 效果最佳， 總識(shí)別率達(dá)到97%. SIMCA法的準(zhǔn)確率較低， 是因?yàn)槠渲皇菍?duì)各個(gè)主成分模型進(jìn)行簡單擬合， 容易受到各種因素的干擾. 與SIMCA法相比， KNN法對(duì)每一個(gè)待測(cè)樣本進(jìn)行分類預(yù)測(cè)都需要計(jì)算其與全體訓(xùn)練集樣本之間的距離， 因此其誤差會(huì)較小， 準(zhǔn)確率較高. 但是對(duì)于金線蓮這種產(chǎn)地之間差異變量多， 變量差異性小的樣本集來說， 提取的主成分?jǐn)?shù)量少時(shí)會(huì)造成信息缺失， 訓(xùn)練集和測(cè)試集的準(zhǔn)確率都很低， 而提取的主成分?jǐn)?shù)量多時(shí)， KNN法的泛化特性會(huì)導(dǎo)致訓(xùn)練集識(shí)別率隨著更多有效信息的加入而提高， 但是測(cè)試集的識(shí)別效果卻因?yàn)闃颖揪嚯x泛化大大降低. PLS-DA法與FDA法的準(zhǔn)確率都要高于KNN法， 是因?yàn)镻LS-DA法與FDA法作為線性模式的分類方法， 都對(duì)自變量進(jìn)行重新投影來尋找一種更利于進(jìn)行組間分類的線性組合從而進(jìn)行判別， 因此其更能區(qū)分變量間的微小差異. 不同產(chǎn)地金線蓮之間的變量之間較為獨(dú)立， 即不是互相轉(zhuǎn)化引起的成分差異性變化. 因此采用正交投影方法最大化方差來增大組間距離， 從而區(qū)分不同組別物質(zhì)的FDA法的識(shí)別正確率, 會(huì)比依賴于對(duì)相互依賴變量之間進(jìn)行回歸分析到達(dá)分類目的的PLS-DA法更好一點(diǎn).

3 結(jié)語

研究通過使用質(zhì)子傳遞反應(yīng)-飛行時(shí)間儀采集了不同產(chǎn)地金線蓮VOCs指紋圖譜， 并將其與幾種數(shù)學(xué)分類識(shí)別模型相結(jié)合， 篩選最適合金線蓮產(chǎn)地鑒別的分類模型. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為4， 判別分析方法為FDA時(shí)， 識(shí)別效果最好. 分析可知， 對(duì)于具有各種微小差異成分的不同產(chǎn)地金線蓮來說， FDA法建立的分類模型更為適用. 該方法具有快速、 準(zhǔn)確、 無需樣品前處理， 操作簡單等優(yōu)點(diǎn)， 為食品安全快速分析檢測(cè)提供了一種新思路. 該方法同樣可以推廣應(yīng)用到其他農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源中.