新型材料固定化氧化還原酶研究進(jìn)展

王世珍， 劉凱瀧， 王世燕， 江亮， 段凌暄， 熊雨， 季哲惠

(廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361005)

0 引言

氧化還原酶催化生命體內(nèi)各種氧化還原過(guò)程， 不僅可用于制備手性化合物、 開(kāi)發(fā)體外診斷試劑和酶?jìng)鞲衅鳎?也可為生物電催化合成平臺(tái)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)[1]. 氧化還原酶由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 具有輔酶和底物等多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)， 且往往由多個(gè)亞基組成， 因此在反應(yīng)過(guò)程中容易失活. 提高氧化還原酶的穩(wěn)定性主要有酶分子結(jié)構(gòu)改造和固定化兩種途徑.

氧化還原酶固定化主要通過(guò)創(chuàng)造生物相容性好的微環(huán)境和限域空間抑制酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的熱振動(dòng)以提高酶的穩(wěn)定性. 基于新型材料的固定化新方法可拓展在電驅(qū)動(dòng)催化、 非水相體系以及高溫高壓等反應(yīng)條件的生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用[2]. 對(duì)于氧化還原酶的固定化， 在材料選取和固定化方法選擇等需多方面考慮， 包括酶固定化載體的化學(xué)組成、 界面性質(zhì)以及微觀(guān)結(jié)構(gòu)等對(duì)酶穩(wěn)定性、 電子傳遞、 底物和產(chǎn)物擴(kuò)散過(guò)程的影響. 目前廣泛使用的載體材料分為高分子材料、 碳材料、 聚合物-無(wú)機(jī)復(fù)合材料、 金屬-有機(jī)框架材料(metal organic framework, MOF)等(見(jiàn)圖1). 這些材料具有穩(wěn)定性好、 機(jī)械強(qiáng)度高、 化學(xué)惰性、 孔隙率高、 比表面積大等優(yōu)勢(shì)， 并可通過(guò)表面可控修飾， 獲得生物相容性好的固定化載體.

圖1 固定化酶材料分類(lèi)Fig.1 Classification of materials for enzyme immobilization

導(dǎo)電材料固定化氧化還原酶可用于生物傳感器和生物電催化合成等領(lǐng)域. 通過(guò)設(shè)計(jì)、 功能修飾獲得具有導(dǎo)電性能的生物相容性材料， 進(jìn)一步構(gòu)建酶電催化反應(yīng)器， 可實(shí)現(xiàn)高效生物電催化， 推動(dòng)綠色生物制造發(fā)展. 復(fù)合導(dǎo)電材料主要是導(dǎo)電性材料， 如石墨烯、 碳納米管等碳材料， 以及金屬氧化物、 導(dǎo)電MOF與高分子形成復(fù)合材料. Mazurenko等[3]從促進(jìn)電子直接傳遞的角度進(jìn)行闡述， 綜述了酶電極表面修飾材料的新進(jìn)展. Kornienko等[4]綜述了酶電極界面導(dǎo)電材料設(shè)計(jì)和修飾的新進(jìn)展.

本研究側(cè)重總結(jié)導(dǎo)電固定化載體的設(shè)計(jì)， 通過(guò)調(diào)控氧化還原酶的微環(huán)境， 提高酶的穩(wěn)定性、 催化效率和電子傳遞速率(見(jiàn)圖2). 固定化材料表界面改造與蛋白工程改造相結(jié)合, 可強(qiáng)化氧化還原酶分子與電極界面的電子傳遞， 可為構(gòu)建高效、 綠色的酶催化反應(yīng)提供思路.

圖2 氧化還原酶固定化方法Fig.2 Strategies of oxidoreductase immobilization

1 碳材料與高分子復(fù)合材料固定化

碳基材料具有高導(dǎo)電性、 導(dǎo)熱性以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)， 因而在固定化酶領(lǐng)域備受青睞. 碳納米材料的表面多為介觀(guān)結(jié)構(gòu)， 且機(jī)械性能優(yōu)異、 比表面積大， 能夠?yàn)槊腹潭ɑ峁┙Y(jié)合位點(diǎn)[5]， 不僅具有較高的吸附能力， 同時(shí)能夠進(jìn)行多種功能化修飾， 是酶固定化的理想載體. 碳材料微觀(guān)形貌各異， 電子傳遞性能和生物相容性也有較大差異. 其中導(dǎo)電碳材料， 如石墨烯及其衍生物、 碳納米管和碳布等是研究熱點(diǎn)， 被廣泛作為納米載體應(yīng)用于酶電極、 生物燃料電池和生物電催化等各個(gè)領(lǐng)域.

1.1 石墨烯

石墨烯是一種二維片層材料， 單層厚度為0.335 nm， 其結(jié)構(gòu)是由碳原子以sp2雜化形成的穩(wěn)定的六元環(huán)， 最早由英國(guó)科學(xué)家在2004年通過(guò)機(jī)械剝離的方式獲得. 由于其在機(jī)械性能、 穩(wěn)定性方面優(yōu)越的理化特性， 將石墨烯材料應(yīng)用于酶固定化得到了廣泛的關(guān)注和研究.

Skoronski 等[6]采用物理吸附和共價(jià)鍵方法將米曲霉漆酶固定在石墨烯上， 兩種固定化方法均拓展了漆酶的pH耐受范圍， 并提高了酶的最適催化溫度. 物理吸附固定化的酶在第二次反應(yīng)后迅速失去活性， 而共價(jià)固定化酶在重復(fù)利用6次反應(yīng)后仍保持約80%的活性. 但是單純利用石墨烯吸附固定化酶效率較低， 缺乏官能團(tuán)會(huì)展現(xiàn)出較低的固定化酶催化活性[7]， 需要對(duì)石墨烯載體進(jìn)行改性.

Shan等[8]報(bào)道了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和離子液體功能化的聚乙烯亞胺(PFIL)修飾石墨烯材料， 作為固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的載體， 構(gòu)建的生物傳感器具有更寬的線(xiàn)性檢測(cè)范圍. 將石墨烯與導(dǎo)電高分子結(jié)合， 復(fù)合材料兼有無(wú)機(jī)材料和高分子有機(jī)材料兩者的優(yōu)點(diǎn)， 將其用于生物傳感器可以有效提高傳感器的靈敏度和響應(yīng)電流， 縮短響應(yīng)時(shí)間[9].

Seelajaroen等[7]將甲酸脫氫酶(FDH)交聯(lián)固定在石墨烯上， 進(jìn)一步固定化到碳?xì)稚汐@得GO-FDHs-海藻酸鹽碳?xì)?種不同脫氫酶修飾電極， 可高效地進(jìn)行電子傳遞， 并將二氧化碳還原為甲醇， 催化反應(yīng)20 h基本活性不下降. 對(duì)石墨烯進(jìn)行改性得到的復(fù)合材料在作為酶載體領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣泛， Ji等[10]對(duì)石墨烯/聚合物復(fù)合纖維材料的制備、 性能和應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述.

1.2 氧化石墨烯

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)表面豐富的官能團(tuán)如羧基(-COOH)、 羥基(-OH)和環(huán)氧基(-O-)等含氧官能團(tuán)， 具有可修飾性高和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)， 增加了氧化石墨烯的化學(xué)反應(yīng)活性， 并擴(kuò)大了石墨烯平面層之間的間距[11]. 酶可基于共價(jià)鍵固定在氧化石墨烯上， 也通過(guò)靜電、 氫鍵和π-π等弱相互作用進(jìn)行非共價(jià)固定化.

Lin等[12]制備了鎳離子配位氧化石墨烯復(fù)合材料(GO-Ni)， 作為固定化甲酸脫氫酶的新型載體. 與GO-FDH相比， GO-Ni的酶負(fù)載量提高了5.2倍. GO-Ni-FDH的熱穩(wěn)定性、 貯存穩(wěn)定性和重復(fù)再利用穩(wěn)定性均優(yōu)于GO-FDH. 作者從配位鍵、 靜電力等方面研究了酶與氧化石墨烯的多重相互作用機(jī)理. Zhou等[13]通過(guò)雙亞胺活化的酰胺化反應(yīng)定向固定化葡萄糖氧化酶(GOD)， 且游離GOD和定向固定化GOD的Km值相近， 說(shuō)明固定化未影響酶和底物的結(jié)合. Samsam等[14]以戊二醛將乳過(guò)氧化物酶(LPO)共價(jià)固定在功能化氧化石墨烯上. 固定化后酶基本沒(méi)有失活， 且固定化酶在12次循環(huán)使用后， 仍有50%的催化活性， 而游離酶僅余30%的活性. 室溫儲(chǔ)藏30 d后， 固定化酶保留64%活性， 而游離酶則已失活.

氧化石墨烯固定化酶在生物微反應(yīng)器中的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn). Li等[15]報(bào)道了氧化石墨烯(GO)和L-乳酸脫氫酶(L-LDH)之間利用疏水相互作用， 通過(guò)層層組裝制備毛細(xì)管電泳(CE)集成的固定化酶微反應(yīng)器(IMERs). 使用5 d后固定化酶的活性仍保持在90%左右. 固定化L-LDH對(duì)丙酮酸和NADH的Km值與游離酶基本一致. 該方法成功地應(yīng)用于啤酒樣品中丙酮酸含量的測(cè)定， 并為毛細(xì)管電泳(CE)集成固定化酶微反應(yīng)器提供借鑒.

氧化石墨烯-高分子復(fù)合材料可以通過(guò)高分子對(duì)石墨烯表面進(jìn)行功能化， 克服由于強(qiáng)靜電和疏水相互作用可能造成的酶構(gòu)象變化和失活等問(wèn)題[16]， 因而廣泛地應(yīng)用于酶固定化領(lǐng)域. Lin等[17]研究了聚乙烯亞胺復(fù)合(polyethylenimine， PEI)的氧化石墨烯(GO-PEI)材料用于固定甲酸脫氫酶. 與氧化石墨烯直接吸附的甲酸脫氫酶相比， GO-PEI固定化酶的熱穩(wěn)定性、 儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)使用穩(wěn)定性均得到增強(qiáng). Zhu等[18]合成鎳離子配位的氧化石墨烯(GO)納米材料， 固定化細(xì)胞色素c氧化酶(CcO). 固定的CcO的轉(zhuǎn)換率高達(dá)每秒240個(gè)O2分子. 本課題組利用聚乙烯亞胺接枝氧化石墨烯(GO)得到 GO-PEI， 固定化苯丙氨酸脫氫酶. 利用Ni2+， Mn2+， Mg2+等金屬離子對(duì) GO-PEI 載體配位后進(jìn)行酶的固定化， 載體以金屬配位、 靜電作用和氫鍵等多種作用力與酶結(jié)合. 通過(guò)調(diào)控 pH值使 PEI 質(zhì)子化， 可降低吸附層對(duì)蛋白的電荷排斥， 提高了酶的負(fù)載量[19]. 這是由于利用高分子或者金屬對(duì)GO進(jìn)行改性修飾能顯著改善GO的間層間距和層間作用力， 使得固定化效果得到提升.

1.3 還原氧化石墨烯

還原氧化石墨烯(CRGO)是由氧化石墨烯進(jìn)行不同程度還原獲得的二維碳材料. 與GO相比， 還原氧化石墨烯表面官能團(tuán)減少， 疏水性增強(qiáng)， 可減少片層間靜電作用引起的堆積現(xiàn)象. CRGO能夠較好保持單層和二維結(jié)構(gòu)， 具有比表面積大、 生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)， 有利于酶等生物催化劑的固定.

Zhang等[20]通過(guò)疏水相互作用將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和草酸氧化酶(OxOx)分別固定在還原氧化石墨烯上， 與氧化石墨烯固定化酶比較， 酶負(fù)載量、 穩(wěn)定性和活性均有提升. Vineh等[21]以戊二醛作交聯(lián)劑， 將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)固定在還原氧化石墨烯上，kcat和kcat/Km分別提高了6.5倍和8.5倍. 其可重復(fù)使用性也顯著提高， 固定化酶在10次催化循環(huán)后仍能保持70%以上的活性. Ormategui等[22]報(bào)道了高疏水性聚合物與石墨烯材料結(jié)合形成水凝膠結(jié)構(gòu), 將還原氧化石墨烯與甲基丙烯酸甲酯(MMA)/丙烯酸丁酯(BA)共聚物自組裝合成復(fù)合水凝膠， 共價(jià)固定化漆酶， 獲得了高效穩(wěn)定的納米生物催化體系. 王世珍等[23]利用金屬配位的還原氧化石墨烯從破胞液中原位分離固定化苯丙氨酸脫氫酶， 具有較高的酶活性回收率. 研究表明, 還原氧化石墨烯的還原程度和固定化體系的鹽濃度對(duì)原位固定化酶具有一定影響， 提高鹽濃度可提高酶活回收率. Zhou等[24]利用聚多巴胺(PDA)修飾氧化石墨烯表面， 得到PDA/rGO生物復(fù)合材料， 固定化葡萄糖氧化酶(GOD). 固定化后的米氏常數(shù)(Km)接近游離酶的米氏常數(shù)， 且固定化酶的熱穩(wěn)定性、 pH穩(wěn)定性、 貯存穩(wěn)定性和對(duì)變性劑的抗性均有顯著提高.

還原氧化石墨烯比石墨烯和氧化石墨烯具有更好的導(dǎo)電性， 因此在生物傳感器和生物電催化中具有良好應(yīng)用前景. Ye等[25]制備了一種由殼聚糖、 還原氧化石墨烯和金納米顆粒組成的復(fù)合材料. 將納米復(fù)合材料沉積在玻碳電極上后固定化葡萄糖氧化酶(GOx)以獲得檢測(cè)葡萄糖的生物傳感器. 該生物傳感器靈敏度為13.58 μA· (mmol·L-1·cm2)-1, 檢測(cè)限為0.52 μmol·L-1， 米氏常數(shù)Km為2.39 mmol·L-1， 且檢測(cè)線(xiàn)性范圍寬. Berchmans等[26]使用聚酰胺-胺型樹(shù)狀聚合物與還原氧化石墨烯共價(jià)結(jié)合. 通過(guò)戊二醛共價(jià)固定化辣根過(guò)氧化物酶實(shí)現(xiàn)H2O2檢測(cè)， 該酶?jìng)鞲衅鞅憩F(xiàn)出良好的穩(wěn)定性. Hua等[27]將葡萄糖氧化酶(GOD)固定在電化學(xué)還原的氧化石墨烯(ERGO)上， 進(jìn)一步吸附在聚L-賴(lài)氨酸(PLL)修飾的玻碳電極上. GOD/ERGO/PLL/GC電極可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的直接電子轉(zhuǎn)移， 具有良好的電催化活性， 其線(xiàn)性范圍為0.25～5.00 mmol·L-1. Wu等[28]以聚乙烯亞胺和還原氧化石墨烯(PEI-rGO)的復(fù)合材料固定化膽固醇氧化酶(ChOx)， 采用逐層組裝的方法制備了電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái). 測(cè)定其表觀(guān)Km為0.0431 mmol·L-1， 表明固定化后的ChOx與膽固醇有良好的親合力. 由于PEI-rGO復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性能， 固定化后的ChOx在玻碳電極(GCE)上的電子轉(zhuǎn)移能力大幅度增強(qiáng).

1.4 碳納米管(CNTs)

石墨烯通過(guò)圍繞旋轉(zhuǎn)軸卷曲可形成碳納米管， 由于其高長(zhǎng)徑比， 因此通常被認(rèn)為是一維材料. 碳納米管具有高比表面積、 良好導(dǎo)電性和高機(jī)械強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)， 作為一種高效的固定化支撐材料， 被廣泛應(yīng)用于催化、 材料制備等領(lǐng)域.

本課題組以聚多巴胺(PDA)修飾的多壁碳納米管為載體固定化氧化還原酶. 多巴胺表面富含伯氨基和酚羥基， 可以與金屬離子進(jìn)行配位形成配體聚合物(PDA-M)， 增強(qiáng)MWCNTs親水性以及載體與酶的相互作用. PDA-M配位固定化苯丙氨酸脫氫酶， 酶活回收率提升2倍. 固定化酶在高溫下和有機(jī)溶劑體系中穩(wěn)定性增強(qiáng)， 展現(xiàn)出了良好的抗逆性能. Zhang等[29]通過(guò)水熱反應(yīng)將磁性Fe3O4與多壁碳納米管合成了Fe3O4/MWCNTs復(fù)合材料固定化辣根過(guò)氧化物酶， 用于去除廢水中的酚類(lèi)物質(zhì). 固定化酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性?xún)?yōu)于游離酶. Cai等[30]制備CTS修飾的磁性碳納米管(CTS-Fe3O4/CNTs)固定化辣根過(guò)氧化物酶， 提高了酶的耐熱性和pH耐受性、 重復(fù)利用次數(shù)和保存時(shí)間. 將酶固定在碳納米管及其衍生的納米復(fù)合材料， 因其具有效的負(fù)載能力和良好的機(jī)械性能等， 有助于構(gòu)建具有廣泛工業(yè)生物應(yīng)用前景的納米生物催化體系.

碳納米管可深入酶的活性中心， 為酶和電極之間構(gòu)筑良好的電子轉(zhuǎn)移通道， 同時(shí)也推動(dòng)了以此為基礎(chǔ)的酶?jìng)鞲衅骱蜕镫姶呋难芯? Bahar等[31]利用多壁碳納米管(MWCNTs)、 聚乙烯亞胺(PEI)和碳布固定化葡萄糖氧化酶， 獲得帶活性醛基團(tuán)的固定化酶電極. 通過(guò)共價(jià)交聯(lián)， 固定化酶作為生物陽(yáng)極的半衰期從27.2 h提高到124.7 h， 提高了4倍以上. 與非交聯(lián)固定化酶在電極上的動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比， 交聯(lián)酶電極的表觀(guān)Km僅增加了16%， 而最大反應(yīng)速率vmax僅降低了3%. Hyun等[32]提出通過(guò)加入陽(yáng)離子表面活性劑和穩(wěn)定劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)對(duì)葡萄糖氧化酶基于物理吸附固定化， 明顯改善碳納米管葡萄糖傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性. Wee等[33]利用CNTs固定化酪氨酸酶(TYR)制備電極， 開(kāi)發(fā)出高靈敏度的酚類(lèi)生物傳感器. 分別制備TYR通過(guò)吸附(EA)、 沉淀(EAC)和交聯(lián)(EAPC)獲得的固定化樣品. EAPC與酶吸附和酶吸附/交聯(lián)相比， TYR活性分別提高10.5和5.4倍. 這種高敏感酶生物傳感器在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境污染物方面具有巨大的應(yīng)用潛力. Mao課題組[34]利用乙醇、 乙腈和丙酮等有機(jī)溶劑的表面浸潤(rùn)效應(yīng)調(diào)控酶和電極之間的相互作用， 優(yōu)化碳納米管表面酶分子的取向， 促進(jìn)酶分子的直接電子轉(zhuǎn)移， 可有效提高生物電化學(xué)催化的性能. 在制備漆酶-碳納米管復(fù)合物的過(guò)程中， 加入20%乙醇溶液明顯提高電極對(duì)于氧氣電化學(xué)催化的電流. 乙醇分子吸附于碳納米管表面提高其浸潤(rùn)性. 碳納米管曲面與漆酶凹槽的對(duì)接， 通過(guò)優(yōu)化蛋白在碳納米管上的取向促進(jìn)了銅離子活性中心與電極間的高效直接電子傳遞.

碳材料通?？捎霉矁r(jià)法和非共價(jià)法進(jìn)行修飾， 共價(jià)技術(shù)可以獲得具有強(qiáng)相互作用的碳基復(fù)合材料. 共價(jià)固定化碳納米管-酶配合物具有獨(dú)特的理化性能， 如高催化性能、 穩(wěn)定性、 低傳質(zhì)阻力和高效回收率. 非共價(jià)固定化方法能夠保持碳材料的結(jié)構(gòu)等固有的特性， 同時(shí)改善材料的可分散性和穩(wěn)定性. 與共價(jià)法相比， 非共價(jià)法能夠更好地保持酶的天然構(gòu)象[10]. 非共價(jià)相互作用包括π-π鍵作用、 氫鍵作用、 靜電作用、 配位鍵和范德華力， 這些相互作用力影響著碳材料與酶之間的相互作用. 在酶吸附碳材料的過(guò)程中， 芳香族氨基酸與碳材料形成的π-π作用是主要的推動(dòng)力[35]. 對(duì)碳材料表面的修飾會(huì)顯而易見(jiàn)地影響酶與固定化載體的相互作用， 而酶與固定化載體界面的相互作用力仍然有待深入研究， 選擇合適的酶固定化方法仍需要考慮酶本身的性質(zhì)、 碳材料的特點(diǎn)以及經(jīng)濟(jì)性等因素.

碳材料的性質(zhì)各有千秋， 因此在固定化酶領(lǐng)域用途不同. 碳材料固定化氧化還原酶的優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示[25, 36-37].

表1 固定化酶常用碳材料的優(yōu)缺點(diǎn)

2 金屬-有機(jī)框架固定化酶

金屬-有機(jī)框架是發(fā)展迅速的高結(jié)晶性多孔材料. 由于MOF材料結(jié)構(gòu)可調(diào)， 可用于設(shè)計(jì)、 構(gòu)建剛?cè)岵?jì)的生物-化學(xué)復(fù)合納米催化劑. 有機(jī)配體類(lèi)型眾多， 結(jié)合不同種類(lèi)金屬離子基于配位數(shù)， 可以形成不同孔徑的骨架結(jié)構(gòu). 因此， MOF在酶的固定化方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

Stoddart等[38]報(bào)道了利用NU-100x(x=3, 4, 5, 6, 7)系列鋯基MOF， 通過(guò)調(diào)控其多級(jí)介孔結(jié)構(gòu)的孔道尺寸實(shí)現(xiàn)乳酸脫氫酶(LDH)的固定化負(fù)載. 固定在NU-100x大孔中的酶可高效催化底物并實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的原位再生. 溫莉茵[39]所制備的金屬有機(jī)框架材料納米多酶催化體系可用于CO2的還原， 反應(yīng)時(shí)間為2 h, 甲酸產(chǎn)量高達(dá)23.86 μmol， 多酶偶聯(lián)體系的活性遠(yuǎn)高于游離酶.

原位合成法是指將酶溶液與MOFs的前體(如金屬鹽和配體) 混合在一起， 在MOFs結(jié)構(gòu)的形成、 生長(zhǎng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)酶包埋的固定化策略. Xia等[40]將醇脫氫酶(ADH)封裝到金屬有機(jī)骨架HKUST-1晶體中， 構(gòu)建了化學(xué)-酶法催化體系. HKUST-1可以實(shí)現(xiàn)輔酶β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的原位再生. 固定化酶與游離酶相比， 能耐受尿素和有機(jī)溶劑， 并且在6個(gè)循環(huán)后仍保持93%的活性. ADH@HKUST-1復(fù)合材料的產(chǎn)物收率達(dá)28.5%， 比游離酶高4.3倍. 該課題組還將葡萄糖氧化酶(GOx)和具有過(guò)氧化物酶活性的金屬有機(jī)骨架MOF-545(Fe)組合起來(lái)， 構(gòu)建了化學(xué)-酶法耦聯(lián)催化體系[41]. GOx@MOF-545(Fe)可快速檢測(cè)葡萄糖， 具有低檢測(cè)限(0.28 μmol·L-1)和高特異性等優(yōu)勢(shì)， 并表現(xiàn)出優(yōu)異的可重復(fù)使用性和穩(wěn)定性. 在室溫下保存7 d后仍保留了92%的活性， 而游離酶僅保留了40%的活性. 重復(fù)利用5個(gè)循環(huán)后， 固定化酶還能保持71%的活性.

基于鋯(Zr)的MOF材料(NU-10xx系列)在各種酸性和堿性環(huán)境中均有出色的穩(wěn)定性， 常用作酶的固定化載體. Zhang等[42]使用Zr4+和2-甲基咪唑(2MIm)形成的配位聚合物(CPs), 在水性環(huán)境中通過(guò)簡(jiǎn)單的兩步法, 合成了共固定化的多酶納米反應(yīng)器. 使用6-磷酸葡萄糖脫氫酶和α,β-不飽和酮還原酶形成的多酶耦聯(lián)體系(G6PD@Zr-2MIm / KRED)可用作NADPH輔酶再生的酶反應(yīng)器. 此多酶體系表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性， 在高溫和不同pH值下均具有良好的耐受性. 且該反應(yīng)器反應(yīng)15 min可獲得95%以上的轉(zhuǎn)化率. 保存4 d后活性保留70%， 進(jìn)行4次重復(fù)利用后， 活性保留80%. Chen等[43]將甲酸脫氫酶(FDH)固定在NU-1006中， 通過(guò)在玻碳電極上共沉積電子中介體和酶@MOF， 高效電催化CO2生成甲酸的體系. FDH@NU-1006轉(zhuǎn)化NADH的效率比游離FDH高約3倍， 并可實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的再生.

Torkzadeh等[44]合成了Fe3O4NPs@Ni-MOF材料， 用于固定D-乳酸脫氫酶(D-LDH). 利用分子動(dòng)力學(xué)模擬， 研究了Fe3O4NPs@Ni-MOF對(duì)D-LDH的吸附和構(gòu)象的影響. MOF中的Ni離子與酶的氨基酸殘基形成π-π相互作用. Fe3O4NPs@Ni-MOF有效保護(hù)了酶的構(gòu)象， 減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化， 從而提高了酶的熱穩(wěn)定性.

蛋白質(zhì)與疏水表面的相互作用常常引起酶的構(gòu)象變化， 導(dǎo)致變性以及失活. Liang等[45]比較了不同親疏水性的3種MOF固定化酶的效果. 選取親水性的MAF-7、 ZIF-90和疏水性的ZIF-8， 分別固定化過(guò)氧化氫酶和脲酶. 當(dāng)這兩種酶封裝于親水性的MOF中時(shí)， 在高溫和有機(jī)溶劑等環(huán)境中酶穩(wěn)定性較好. 而采用疏水性的MOF固定化酶， 在同樣的反應(yīng)條件下基本無(wú)活性. 此結(jié)果表明， 優(yōu)化酶和封裝材料之間的疏水/親水相互作用， 對(duì)于高效封裝和提高生物分子穩(wěn)定性至關(guān)重要. MOF材料固定化氧化還原酶的代表性例子如表2所示.

表2 MOF材料固定化氧化還原酶

共價(jià)有機(jī)框架(covalent organic frameworks, COFs)是通過(guò)可逆共價(jià)鍵連接的多孔有機(jī)材料. 因具有高比表面積、 低密度、 規(guī)則的孔隙和易于功能化表面等優(yōu)點(diǎn)， COFs固定化酶領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力[46]. 通過(guò)改變COF上的官能團(tuán)可調(diào)控COF與酶之間的特定相互作用， 而COF連續(xù)的孔道為固定化酶提供了良好的微環(huán)境[47]. Li等[48]提出一種固定化酶新策略， 先用MOFs對(duì)酶進(jìn)行固定后， 通過(guò)除去MOF中的金屬離子， 將酶釋放到所合成的COF膠囊中. COF膠囊較大的空間尺寸提供給酶較大的自由度， 有利于其構(gòu)象的保持并提供催化和傳質(zhì)所需的空間， 從而大大提高固定化酶的活性. 該固定化策略可為多酶固定化以及多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)提供新的平臺(tái).

優(yōu)化MOF和COF內(nèi)部酶的構(gòu)象和空間分布、 反應(yīng)物及底物接觸、 輔因子和底物的擴(kuò)散等是MOF材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵. 且要實(shí)現(xiàn)高效的多酶催化和輔酶電再生的生物串聯(lián)反應(yīng)仍是挑戰(zhàn). 然而， 具有導(dǎo)電性能的MOF和COF固定化酶還鮮見(jiàn)報(bào)道.

3 總結(jié)與展望

目前, 新型材料固定化氧化還原酶研究主要基于調(diào)控酶與載體相互作用力進(jìn)行微觀(guān)表界面設(shè)計(jì)， 構(gòu)建生物相容性的微環(huán)境. 采用的新策略主要包括導(dǎo)電高分子修飾、 碳材料界面可控修飾、 離子液體等小分子修飾、 改性等. 本研究主要考察新型載體的化學(xué)組成、 表界面性質(zhì)等對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)、 穩(wěn)定性、 催化本征和表觀(guān)動(dòng)力學(xué)、 底物和產(chǎn)物傳遞過(guò)程的影響機(jī)制.

目前該領(lǐng)域主要存在的難點(diǎn)包括： 載體多尺度組裝與可控修飾、 酶與材料界面相互作用力的精確調(diào)控， 基于多層次作用力組裝構(gòu)建仿生界面等. 針對(duì)這些問(wèn)題， 提出以下解決方案.

1) 固定化酶材料元件的精準(zhǔn)構(gòu)筑. 發(fā)展基于微納制造的方法， 將生物大分子的固定于微電極和陣列電極. 通過(guò)3D打印、 靜電紡絲等在內(nèi)的催化劑界面構(gòu)筑方法， 設(shè)計(jì)和調(diào)控載體孔徑， 實(shí)現(xiàn)酶和載體孔道之間的尺寸匹配[49].

2) 仿生固定提高生物催化劑的穩(wěn)定性. 通過(guò)模擬自然界酶天然固定化的環(huán)境， 基于多層次相互作用力的仿生組裝. 研究固定化酶和多酶體系催化反應(yīng)體系的協(xié)同和強(qiáng)化方法， 探索區(qū)域化效應(yīng)等對(duì)酶分子內(nèi)和界面的底物, 電子傳遞以及酶催化效率的影響機(jī)制； 原位固定化酶以減少分離純化過(guò)程的酶活損失， 降低時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本[50].

3) 固定化酶的大規(guī)模制備技術(shù)與工程放大. 針對(duì)具有工業(yè)應(yīng)用背景的酶固定化體系， 探索適合規(guī)模化應(yīng)用的新型通用性酶特異固定化技術(shù)、 工程放大技術(shù)和反應(yīng)器設(shè)計(jì). 開(kāi)發(fā)適合規(guī)模化制備的、 結(jié)構(gòu)表面組成孔徑尺寸可控的新型通用性酶固定化載體材料[51].

4) 復(fù)合生物相容性導(dǎo)電材料. 設(shè)計(jì)新型環(huán)境響應(yīng)的材料， 提供新的固定化機(jī)制并促進(jìn)電極與生物催化劑之間的電子傳遞效率， 提高生物催化劑的電催化活性. 通過(guò)離子液體等導(dǎo)電分子修飾固定化材料， 優(yōu)化酶與電極界面電子傳遞， 有利于酶催化性能的增強(qiáng)， 將其用于生物傳感器可以有效提高傳感器的靈敏度和響應(yīng)電流. 新型材料固定化氧化還原酶在開(kāi)發(fā)納米結(jié)構(gòu)或介導(dǎo)再生的修飾電極以及開(kāi)發(fā)微反應(yīng)器中降低過(guò)電位和減少副反應(yīng)實(shí)現(xiàn)更高效率的輔酶電再生有很大的空間[52].