毛果楊PLD基因家族全基因組水平鑒定及其鹽脅迫下的表達(dá)分析

劉 聰，張 洋，夏德安，陳雪冰，魏志剛

(1. 東北林業(yè)大學(xué)，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 國(guó)家林業(yè)與草原局鹽堿地研究中心，北京 100091)

植物作為固著生物，需要應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿、低溫、高溫以及病蟲害侵襲等多種逆境脅迫，而對(duì)脅迫信號(hào)的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的前提和基礎(chǔ)[1]。研究表明，植物體內(nèi)脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)需要多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)參與，如ABA、乙烯、H2O2和NO等激素和小分子化合物[2]以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白G蛋白[3]、磷脂酶A[4]、磷脂酶C[5]、磷脂酶D（PLD）[6]等激酶，其中，PLD能夠水解磷酸二脂鍵使細(xì)胞膜磷脂產(chǎn)生磷脂酸（PA）和可溶性頭基，而PA是多種激素信號(hào)和脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的第二信使，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜遷移、細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞骨架重排等多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[7-10]。研究表明，PLD的典型特征是具有2個(gè)間隔250～400個(gè)氨基酸的HKD（HxKxxxxD）結(jié)構(gòu)域，雖然2個(gè)HKD在蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)上相距較遠(yuǎn)，但它們?cè)谌?jí)結(jié)構(gòu)上能形成互作，且這種互作也是其酶活性發(fā)揮的關(guān)鍵[11-15]。根據(jù)氨基酸序列特征，PLD可分為α、β、γ、δ、ε、ζ、φ 7種類型，其中，PLDα、PLDγ、PLDδ和PLDζ數(shù)量較多，PLDβ和PLDε數(shù)量較少，而PLDφ發(fā)現(xiàn)較晚且較少見[13,16]。根據(jù)蛋白的N端結(jié)構(gòu)特征和其酶活性對(duì)Ca2+的依賴性，PLD也可分為C2-PLD、PX/PH-PLD和SPPLD 3個(gè)亞族，其中，C2-PLD蛋白的N端含有一個(gè)高度保守Ca2+依賴型磷脂結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域，需要結(jié)合Ca2+以維持酶活性[12]；PX/PH-PLD的N端特征是一個(gè)串連的PX（phox homology）和PH（pleckstrin homology）結(jié)構(gòu)域，活性不依賴于Ca2+[13]；SP-PLD亞家族規(guī)模較小，于2007年在水稻（Oryza sativaL.）中被首次發(fā)現(xiàn)，其N端含有信號(hào)肽，而不是C2、PX或PH結(jié)構(gòu)域[13]。其中，PLDα、PLDβ、PLDγ、PLDδ和PLDε屬于C2-PLD亞家族，PLDζ屬于PX/PH-PLD亞家族，PLDφ屬于SP-PLD亞家族[11]。植物中，首個(gè)PLD于1994年從蓖麻（Ricinus CommunisL.）[17]中克隆出來(lái)后，隨后水稻[18]、擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）[19]、玉米（Zea maysL.）以 及 煙 草（Nicotiana tabacumL.）[20]等多個(gè)物種中相繼被克隆出PLD。隨著多個(gè)植物全基因組序列的發(fā)布[21-27]，人們發(fā)現(xiàn)PLD在植物中多以基因家族形式存在，如PLD家族成員擬南芥有12個(gè)[12]、水稻有17個(gè)[13]、白菜（Brassica rapaLour.）有18個(gè)[14]、亞洲棉（Gossypium arboreumL.）有19個(gè)[11]、葡萄（Vitis viniferaL.）有11個(gè)[28]、大豆（Glycine maxL.）有18個(gè)[15]等。

研究發(fā)現(xiàn)，PLD在植物響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)中有著重要作用，如在擬南芥中，AtPLDα1的沉默會(huì)嚴(yán)重減弱植株由ABA誘導(dǎo)的耐旱反應(yīng)[29]；Atpldα1缺陷型株系中由創(chuàng)傷誘導(dǎo)的 JA合成和相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低[30]；Atpldδ缺陷型株系對(duì)H2O2脅迫的敏感性顯著上升[31]；AtPLDδ在響應(yīng)真菌（Blumeria graminisDC.）脅迫的防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有著關(guān)鍵作用，Atpldδ突變體株系中響應(yīng)微生物的早期應(yīng)激響應(yīng)基因的上調(diào)表達(dá)被顯著延遲[32]；C2-PLD突變體株系在響應(yīng)缺氧脅迫過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)PA和胞質(zhì)鈣的含量上升顯著受阻[33]；在其他植物中，如在毛白楊（Populus tomentosaCarr.in Rev.Hort.）中過(guò)表達(dá)AtPLDα1能夠顯著提高其耐鹽性與耐旱性[34]；過(guò)表達(dá)黃瓜（Cucumis sativusL.）CsPLDα的煙草抗旱性增強(qiáng)[35]；小麥（Triticum aestivumL.）TaPLDα能夠響應(yīng)多種脅迫下表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)TaPLDα的擬南芥耐旱能力顯著增強(qiáng)[36]。由此可見，PLD家族在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)具有重要生物學(xué)功能。

毛果楊（Populus trichocarpaTorr. & Gray）是首個(gè)全基因組測(cè)序的木本植物[37]，也是研究木本植物生長(zhǎng)發(fā)育、材質(zhì)材性、逆境脅迫響應(yīng)和其他重要性狀的模式植物。然而，目前為止，尚無(wú)毛果楊PLD家族鑒定及其在逆境脅迫響應(yīng)特性的研究報(bào)道。本項(xiàng)研究在全基因組水平鑒定出毛果楊PLD家族全部成員的基礎(chǔ)上，對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化、同源關(guān)系、選擇壓力在其家族進(jìn)化中的作用、基因結(jié)構(gòu)、家族各基因的順式作用元件和蛋白保守基序進(jìn)行分析，從而全面闡述該基因家族的基本特征。此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和已報(bào)道的毛果楊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)其PLD家族基因的組織表達(dá)特性以及鹽脅迫的響應(yīng)特性進(jìn)行分析。本研究為進(jìn)一步闡明毛果楊PLD家族基因的生物學(xué)功能和抗逆基因的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛果楊PLDs家族成員鑒定及基本特征分析

利用報(bào)道的擬南芥PLD的氨基酸序列比對(duì)Phytozome網(wǎng)站（https://phytozome.jgi.doe.gov）中的毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，同時(shí)在毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)檢索已注釋的PLD，將獲得的序列結(jié)果匯總并剔除重復(fù)序列后作為候選基因。為了驗(yàn)證初始結(jié)果的可靠性，將候選基因的氨基酸序列上傳至HMMER網(wǎng)站 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer)以及NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）鑒定保守結(jié)構(gòu)域，以含有2個(gè)間隔250～400氨基酸的PLD典型HKD結(jié)構(gòu)域（HMM模型登錄號(hào)為PF00614）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域鑒定蛋白類型，最終鑒定出毛果楊PLD家族全部成員[11,14,38-40]。

從Phytozome網(wǎng)站中獲得PtrPLD家族成員的染色體位置、基因序列和開放閱讀框長(zhǎng)度等信息，并根據(jù)基因編碼蛋白類型和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行命名，染色體位置信息經(jīng)Tbtools軟件進(jìn)行可視化處理[41]。通過(guò)ExPasy（https://web.expasy.org）在線預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)與分子質(zhì)量[42]，通過(guò)Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)在線預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位位置[43]。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將鑒定出的毛果楊全部PtrPLDs以及擬南芥AtPLDs編碼的氨基酸序列在MEGA X軟件的ClustaW程序中進(jìn)行多重序列比對(duì)[44]。采用鄰近法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中，bootstrap設(shè)置1 000次重復(fù)，再經(jīng)最大似然法（Maximum-likeihood）驗(yàn)證，得到系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹數(shù)據(jù)，經(jīng)Evoview（https://www.evolgenius.info/evolview/）網(wǎng)站可視化處理[12,44-45]。

1.3 同源基因?qū)Φ腒a和Ks分析

Blast相互比對(duì)PtrPLDs的CDS序列，超過(guò)300個(gè)bp且同源性超過(guò)80%為標(biāo)準(zhǔn)確定為同源基因?qū)46-47]，同源關(guān)系經(jīng)Tbtools軟件可視化處理[41]。利用Tbtools軟件計(jì)算同源基因?qū)χg的同義替換率（Ks）、非同義替換率（Ka）以及Ka/Ks比率，并以此分析PtrPLD家族基因進(jìn)化過(guò)程中的選擇壓力[41, 46, 48]。

1.4 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守型基序分析

從毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)（https://genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf?organis m=Ptrichocarpa）下載基因組數(shù)據(jù)后，通過(guò)TBtools軟件提取各PtrPLD外顯子、內(nèi)含子長(zhǎng)度及位置信息并進(jìn)行可視化處理[41]。

將各PtrPLD氨基酸序列提交到Motif Elicitation網(wǎng)站的MEME程序（http://meme-suite.org/tools/meme）中分析保守基序并進(jìn)行可視化處理[41,49]。

1.5 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

在 Phytozome網(wǎng) 站（https://phytozome.jgi.doe.gov）中將各PtrPLD起始密碼子前2 000 bp的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域匯總，再上傳至Plantcare網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行順式作用元件在線分析[46]。

1.6 PtrPLD家族基因的組織表達(dá)及其對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)特性分析

組織表達(dá)特異性：在Phytozome網(wǎng)站（https://phytozome.jgi.doe.gov）中下載各PtrPLD在各組織中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，再采用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。野生型毛果楊來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，用組織培養(yǎng)的方法擴(kuò)繁后，將1月大小的組培苗移植到土壤中，在25℃、長(zhǎng)日照（光照16 h黑暗8 h）溫室中培養(yǎng)3周。分別采集根、莖和葉組織，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA用于qRT-PCR。每組處理重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并利用Tbtools可視化[41]。

鹽脅迫下的響應(yīng)特性：將1月大小的組培苗移植到土壤中，在25℃、長(zhǎng)日照（光照16 h黑暗8 h）溫室中培養(yǎng)3周時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗隨機(jī)分成7組，每組包含5棵毛果楊幼苗。用100 mmol·L-1NaCl處理3、6、12、24、36、72 h，同時(shí)用水處理作為對(duì)照組。分別采集上述處理組內(nèi)各植株材料的根、莖和葉組織，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA進(jìn)行qRT-PCR分析。每組處理重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并利用Tbtools可視化[41]。

RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR：利用植物總RNA提取試劑盒（MiniBEST，TaKaRa）提取總RNA，然后采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒反轉(zhuǎn)錄 RNA獲得 cDNA用于 qRT-PCR。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，利用NCBI Primer-Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer）工具設(shè)計(jì)特異性的PtrPLD家族基因定量引物，以PtrACTIN為內(nèi)參基因（表1），并通過(guò)PCR、電泳驗(yàn)證引物特異性[50]。在賽默飛ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)，體系如下:2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、上下游混合引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 30 s; 94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s，循環(huán)40次; 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。

表1 毛果楊PtrPLD定量引物序列Table 1 PtrPLD quantitative primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrPLD家族成員及其編碼蛋白基本特性

根據(jù)已報(bào)道的AtPLD家族各基因氨基酸序列比對(duì)毛果楊的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到18個(gè)候選基因，再經(jīng)過(guò)HKD結(jié)構(gòu)域且二者間隔250～400個(gè)氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)篩選，剔除Potri.001G112100.1和Potri.T 180000.1（2個(gè)基因所編碼的蛋白中HKD序列不符合HxKxxxxD特征），共得到16個(gè)PtrPLD（表2）。按編碼PLD蛋白類型和進(jìn)化關(guān)系命名為PtrPLDα1到PtrPLDξ3（表2）；同時(shí)，對(duì)PtrPLD家族成員編碼蛋白特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PtrPLD家族基因編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)為 645～1 141、分子量為73.79～129.02 kDa、理論等電點(diǎn)為5.41～6.90、單個(gè)HKD結(jié)構(gòu)域跨度在35個(gè)氨基酸左右、2個(gè)HKD結(jié)構(gòu)域間隔均在300個(gè)氨基酸左右（表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PtrPLDα1和PtrPLDα2定位在細(xì)胞質(zhì)中，PtrPLDα3、PtrPLDα4、PtrPLDα5和PtrPLDα6定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中，PtrPLDβ1定位在葉綠體中，PtrPLDβ2定位在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，PtrPLDδ1～5和PtrPLDξ1～3均定位在細(xì)胞質(zhì)中（表2）。

表2 毛果楊PLD基因及所編碼蛋白的特征Table 2 Characteristics of PLD genes and encoded proteins in Populus trichocarpa

2.2 PtrPLD家族的進(jìn)化關(guān)系

為了解PtrPLD家族成員的進(jìn)化關(guān)系，將16個(gè)PtrPLDs與12個(gè)AtPLDs編碼的蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)擬南芥PLD基因家族進(jìn)化關(guān)系，將PtrPLD家族分為α、β、δ及ζ 4個(gè)類型，其中α類型有6個(gè)，β類型有2個(gè)，δ類型有5個(gè)，ζ類型有3個(gè)，未鑒定出γ、ε和φ類型的PtrPLD（圖1）。結(jié)果表明：毛果楊基因組并不存在SP-PLD亞族，PX/PH-PLD亞家族規(guī)模較小僅有3個(gè)成員，C2-PLD亞家族共有13個(gè)成員。

圖1 毛果楊與擬南芥PLD基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。Fig.1 Phylogenetic analysis of PLD gene family in Populus trichocarpa and Arabidopsis thaliana.

2.3 PtrPLD家族基因擴(kuò)張

為了分析PtrPLD家族擴(kuò)張?jiān)?，利用Tbtools構(gòu)建了家族基因染色體定位圖以及同源關(guān)系圖[41]。結(jié)果表明：毛果楊16個(gè)PtrPLDs不均勻地分布在1、2、3、5、6、7、8、10、13、14和18號(hào)染色體上，其中，3號(hào)染色體上有4個(gè)基因、2號(hào)和5號(hào)染色體上有2個(gè)，其余的染色體上均僅有1個(gè)PtrPLD家族基因（圖2）。

毛果楊PtrPLD家族共線性分析以及序列Blastn分 析 結(jié) 果 表 明：PtrPLDα1和PtrPLDα2、PtrPLDα5和PtrPLDα3、PtrPLDβ1和PtrPLDβ2、PtrPLDδ1和PtrPLDδ4以及PtrPLDδ2、PtrPLDδ3和PtrPLDδ4、PtrPLDξ2和PtrPLDξ3有共線性關(guān)系且同源片段長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于300 bp同源性超過(guò)80%（表3），因此上述基因?qū)κ怯苫驈?fù)制事件的進(jìn)化形成的旁系同源基因[46-47]。其中，3號(hào)染色體上出現(xiàn)由PtrPLDα1、PtrPLDα2和PtrPLDα3形成的基因簇（圖2），PtrPLDα1和PtrPLDα2同源性極高（表3），因此，PtrPLDα1和PtrPLDα2是由基因串聯(lián)復(fù)制事件演化而來(lái)。綜上所述，多數(shù)PtrPLDs具有基因復(fù)制現(xiàn)象，表明基因復(fù)制是PtrPLDs家族擴(kuò)張的主要原因。

表3 同源基因的Ka/Ks比值及同源性Table 3 Ka/Ks values and homologous status of homologous genes

圖2 PtrPLDs基因染色體分布Fig.2 Chromosome distribution of PtrPLDs

為了闡明選擇壓力在PtrPLD家族進(jìn)化中的作用，利用Tbtools分析了PtrPLD家族同源基因的Ks值、Ka值和Ka/Ks值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：7對(duì)同源基因Ka/Ks均遠(yuǎn)小于1（表3），表明PtrPLD家族在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇。

2.4 PtrPLD家族基因結(jié)構(gòu)以及保守域特征

為了解PtrPLD家族各基因系統(tǒng)進(jìn)化與其基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白中保守基序之間的關(guān)系，對(duì)PtrPLD家族基因外顯子與內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：PtrPLD家族各基因的內(nèi)含子和外顯子分布方式在保持家族保守性的同時(shí)，在進(jìn)化過(guò)程中也產(chǎn)生了明顯的分化。除PtrPLDα5和PtrPLDδ3外，其他的家族基因最后一個(gè)外顯子均緊靠3′端UTR（圖3）。同時(shí)，多數(shù)處于同一進(jìn)化分支上的基因結(jié)構(gòu)較為相似，如PtrPLDβ1和PtrPLDβ2均僅含有4個(gè)外顯子；值得注意的是，PtrPLDα1和PtrPLDα2均含有20個(gè)外顯子，但內(nèi)含子與外顯子在基因中的分布松散，同時(shí)，上述2個(gè)基因序列長(zhǎng)度雖然超過(guò)12 000 bp，且遠(yuǎn)大于家族內(nèi)其他基因序列長(zhǎng)度，然而二者編碼氨基酸長(zhǎng)度卻是家族中最短的；此外，PtrPLDβs基因長(zhǎng)度均在5 000 bp以下，但其氨基酸數(shù)量最多，長(zhǎng)度最長(zhǎng)（圖3）。

圖3 PtrPLD家族基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Exon-intron organization analysis of PtrPLD genes

PtrPLD家族基因編碼蛋白具有20個(gè)基序，其中Motif 1、Motif 2、Motif 3 和Motif 4為家族共有基序。雖然不同基因編碼蛋白所含基序數(shù)量與種類存在一定的差異，但相同分支的基因編碼蛋白具有相似的基序組合，而不同亞族、類型間的基序有明顯的區(qū)別（圖4）。上述結(jié)果表明：PtrPLD家族基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)在具有保守性的同時(shí)也產(chǎn)生了明顯分化。

2.5 PtrPLD家族基因啟動(dòng)子元件特征

為了解PtrPLD家族基因可能的生物學(xué)功能和調(diào)控特性，在利用PlantCARE分析家族成員啟動(dòng)子的同時(shí)，結(jié)合PtrPLD家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析各基因啟動(dòng)子元件組成與基因的進(jìn)化之間是否具有相關(guān)性。結(jié)果表明：PtrPLD家族16個(gè)基因啟動(dòng)子中共包含2類、12種、154個(gè)順式作用元件（表4）。一大類是非生物脅迫響應(yīng)元件，如厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）、損傷反應(yīng)元件（WUN-motif）、脅迫響應(yīng)元件（STRE）、MYB干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點(diǎn)（MBS）、DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)（DRE）、抗病和脅迫誘導(dǎo)元件（TC-rich repeats）以及低溫響應(yīng)元件（LTR）；另一大類是植物激素響應(yīng)元件，如生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element）、水楊酸誘導(dǎo)元件（TCA-element）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif 和TGACG-motif）、ABA應(yīng)答元件（ABRE）。

表4 PtrPLD家族基因啟動(dòng)子區(qū)域的各順式作用元件分析Table 4 Analysis of cis acting elements in PtrPLD genes promoter region

PtrPLD家族各基因啟動(dòng)子含有元件的種類和數(shù)量存在差異，其中，PtrPLDδ啟動(dòng)子中含有的順式作用元件數(shù)量最多，如PtrPLDδ4啟動(dòng)子中具有的元件數(shù)量最多（20個(gè)），而PtrPLDα6和PtrPLDξ3啟動(dòng)子中僅含有2個(gè)元件。上述結(jié)果表明，基因在進(jìn)化的同時(shí)，其啟動(dòng)子中元件也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的分化。

此外，在所有順式作用元件中ABA應(yīng)答元件ABRE數(shù)量最多，在11個(gè)PtrPLD啟動(dòng)子中有48個(gè)ABRE，其中，PtrPLDδ1、PtrPLDδ2以及PtrPLDδ4含有的ABRE元件達(dá)8個(gè)；厭氧誘導(dǎo)元件ARE含量次之，共有19個(gè)，分布在PtrPLDα6、PtrPLDδ4、PtrPLDδ2等11個(gè)基因啟動(dòng)子中；而DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)DRE數(shù)量最少，僅4個(gè)，分布在PtrPLDδ1、PtrPLDδ3、PtrPLDδ4和PtrPLDξ3基因啟動(dòng)子中。上述結(jié)果表明：PtrPLD家族不同的亞族基因響應(yīng)植物激素和非生物脅迫的能力存在差異。

2.6 PtrPLD家族基因的組織表達(dá)與鹽脅迫響應(yīng)的特性

為了解PtrPLD家族基因的表達(dá)模式，對(duì)phytozome網(wǎng)站中PtrPLD家族各基因在不同組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：6個(gè)PtrPLDα型蛋白基因中PtrPLDα1、PtrPLDα2和PtrPLDα6在莖中的表達(dá)水平較高，PtrPLDα4和PtrPLDα5在根部的表達(dá)水平較高，PtrPLDα3在嫩葉和根部的表達(dá)水平較高，并未有明顯的表達(dá)部位偏好；2個(gè)PtrPLDβ型蛋白基因在根部的表達(dá)水平均較高；5個(gè)PtrPLDδ型蛋白基因中只有PtrPLDδ2在根、嫩葉和成熟葉的表達(dá)水平較高，其他4個(gè)均在根的表達(dá)量較高；3個(gè)PtrPLDξ型蛋白基因均在莖節(jié)的表達(dá)水平較高，根部次之，葉中表達(dá)量最低（圖5A）。同時(shí)，利用qRT-PCR對(duì)PtrPLD家族各基因在根、莖和葉中的表達(dá)量做進(jìn)一步分析，結(jié)果表明：16個(gè)PtrPLD家族基因中有9個(gè)在根部的表達(dá)水平較高，3個(gè)在莖部表達(dá)水平較高，4個(gè)在葉部表達(dá)水平較高。qRT-PCR與phytozome網(wǎng)站中的基本相符,大部分的基因在根部的表達(dá)水平較高，但不同的是qRT-PCR結(jié)果中的PtrPLDα3和PtrPLDα5在葉中表達(dá)水平較高；3個(gè)PtrPLDξ型蛋白基因中PtrPLDξ1在 葉 部 表 達(dá) 水 平 較 高，PtrPLDξ2和PtrPLDξ3均在根部的表達(dá)量較高（圖5B）；PtrPLDδ2在葉中的表達(dá)水平高于根部的。

圖5 PtrPLD家族基因組織表達(dá)特異性Fig.5 Tissue expression specificity of PtrPLD family genes

為了闡明PtrPLD家族基因的鹽脅迫響應(yīng)特性，利用qRT-PCR對(duì)100 mmol·L-1NaCl脅迫處理3、6、12、24、48、72 h的毛果楊幼苗的根、莖、葉中PtrPLD家族各基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果（圖6）表明：NaCl脅迫對(duì)16個(gè)PtrPLD基因在各組織中表達(dá)均產(chǎn)生了影響；在根、莖、葉3種組織中全部PtrPLD家族基因在鹽脅迫后12 h內(nèi)表現(xiàn)出顯著的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，且大部分是在6 h或12 h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，之后快速下調(diào)，在48 h到72 h之間又略有上升。較為獨(dú)特的是，PtrPLDδ4在莖部的表達(dá)高峰處于脅迫處理72 h時(shí)；PtrPLDα1在根、莖、葉中的48～72 h之間的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)相較于其他PtrPLD的均較明顯。從響應(yīng)速度來(lái)看，葉和莖部中大多數(shù)PtrPLD家族基因響應(yīng)鹽脅迫的快速上升期發(fā)生在3 h或6 h，而在根部中的快速上升期發(fā)生在6 h或12 h。

圖6 不同組織中PtrPLD基因家族在鹽脅迫下的表達(dá)特性Fig.6 Analysis of salt stress expression of PtrPLD family genes in different tissues

此外，各部位中均有部分PtrPLD家族基因在12 h內(nèi)的表達(dá)高峰前出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的情況，而不是在脅迫處理后一直上調(diào)表達(dá)到峰值，如根部中的全部PtrPLDα、PtrPLDδ1、PtrPLDδ3和PtrPLDδ4，莖部的PtrPLDδ2、PtrPLDδ4和PtrPLDδ5，葉部的PtrPLDα2、PtrPLDδ1和PtrPLDδ4。

3 討論

研究表明，PLD以多基因家族的形式存在于擬南芥[12]、水稻[13]、白菜[14]、亞洲棉[11]等植物中，并在脅迫響應(yīng)中起到重要作用[10,17,29,34]。然而，目前為止，尚無(wú)模式植物毛果楊PLD家族基因基本特征及其在逆境脅迫響應(yīng)特性的研究報(bào)導(dǎo)。本研究通過(guò)對(duì)毛果楊全基因組分析，共鑒定出16個(gè)PtrPLD，其編碼蛋白包括3個(gè)PX/PH-PLD和13個(gè)C2-PLD亞家族成員（圖1），這與其它植物中C2-PLD成員數(shù)量相對(duì)較少的情況相同[12]。PtrPLD家族中共有7對(duì)具有旁系同源關(guān)系，其中PtrPLDα1和PtrPLDα2是由基因串聯(lián)復(fù)制事件演化而來(lái)，其余的6對(duì)是由基因組復(fù)制事件演化而來(lái)，這表明基因復(fù)制是PtrPLD基因家族擴(kuò)張的主要原因（圖2和表3）。PtrPLD家族中的7對(duì)同源基因的Ka/Ks比值遠(yuǎn)低于1（表3），表明它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中經(jīng)過(guò)了較強(qiáng)的純化選擇，有害的非同義替換在進(jìn)化過(guò)程消失，極少數(shù)的無(wú)害或有益替換得以保留[48]。上述現(xiàn)象間接證明了PtrPLD家族基因在毛果楊的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。

PtrPLD家族基因編碼蛋白含有多個(gè)基序，表明該基因家族生物學(xué)功能的多樣性。同時(shí)，所有的PtrPLD家族基因編碼蛋白均含有Motif 1～4基序（圖4），表明這4個(gè)基序是該基因家族的特征基序，且是毛果楊生命活動(dòng)所必須的。此外，序列比對(duì)表明，Motif 1中的HKD基序中的甲硫氨酸高度保守，這種現(xiàn)象也存在于其他植物的PLD蛋白中[11,51-52]，因此，推測(cè)Motif 1中的甲硫氨酸是HKD基序功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。

PtrPLD家族成員的表達(dá)特性分析表明，其中9個(gè)家族成員在根部表達(dá)水平較高，3個(gè)在莖部表達(dá)水平較高，4個(gè)在葉部表達(dá)水平較高（圖5）。前期研究認(rèn)為，PLD基因多涉及環(huán)境脅迫響應(yīng)[10,17,29,34]，而根部是植物感知滲透脅迫的首要部位。據(jù)此推測(cè)，在毛果楊根部表達(dá)水平較高的9個(gè)PtrPLD基因可能在根部滲透脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而其余7個(gè)在莖、葉中表達(dá)水平較高的可能在莖部或葉部的脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮功能。此外，phytozome網(wǎng)站中數(shù)據(jù)與qRT-PCR結(jié)果中的組織表達(dá)特性不同的原因可能是所用材料的樹齡不同，同時(shí)它們?cè)诓煌l(fā)育階段中的表達(dá)模式存在差異所致。

上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合下游基因啟動(dòng)子中順式作用元件，從而激活逆境響應(yīng)基因的表達(dá)是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的重要環(huán)節(jié)[53]。因此，對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件的分析，是鑒定分析基因生物學(xué)功能的一項(xiàng)重要內(nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn)，PtrPLD家族基因啟動(dòng)子中含有多種與植物激素和逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的兩大類響應(yīng)元件（表4），表明該基因家族廣泛地參與毛果楊多種逆境脅迫的響應(yīng)。PtrPLD家族基因在鹽脅迫下的響應(yīng)特性也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)氨基酸序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域檢驗(yàn)，在毛果楊中鑒定了16個(gè)PtrPLDs；通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析將其分為2個(gè)亞族，4種類型；利用同源性分析及Ka、Ks分析PtrPLD基因家族說(shuō)明基因復(fù)制是其家族擴(kuò)張的主要?jiǎng)恿?，且在進(jìn)化過(guò)程中受到較強(qiáng)地純化選擇；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹與基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析表明，同一亞族、同一類型的PtrPLD具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域；啟動(dòng)子中順式作用元件分析表明，16個(gè)PtrPLDs均能夠響應(yīng)多種激素和脅迫信號(hào)；組織表達(dá)特異性以及鹽脅迫下的表達(dá)特性分析表明，同一進(jìn)化分支上基因仍具有相同表達(dá)模式，而不同進(jìn)化分支的基因存在功能分化。本研究對(duì)于PtrPLD家族基因生物學(xué)功能的鑒定和抗逆基因資源挖掘具有積極意義。