鹽堿脅迫下文冠果生理響應機制研究

宗建偉，張志龍，薛可欣，王爽爽，楊雨華

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院藝術學院，河南 鄭州 450046)

中國內(nèi)陸鹽堿地以鹽化和堿化混合土壤為主,成分復雜且程度各異, 統(tǒng)稱為鹽堿地土壤[1]，鹽堿化已成為威脅生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。我國鹽堿地所占面積為9.9 × 107hm2[2]。據(jù)全國第二次調(diào)查報告顯示，我國鹽堿地主要分布在東北(黑吉遼)、華北(京津冀)、中北(晉秦隴)、西北(青寧新)等地區(qū)[3]，具有分布廣、面積大、類型多的特點。河南分布著大面積的鹽堿地，這嚴重制約了河南農(nóng)林經(jīng)濟和植物景觀建設的發(fā)展。

開發(fā)和利用鹽堿地資源是進一步挖掘農(nóng)業(yè)發(fā)展?jié)摿?、解決人口和環(huán)境壓力的重要舉措，而選用和推廣耐鹽植物是改良和利用大面積鹽堿土壤最經(jīng)濟、最快捷的措施之一[4]；但鹽堿地區(qū)適生范圍的確定，是耐鹽堿植物大面積推廣亟待解決的關鍵技術。因此，國內(nèi)外眾多科研工作者對研究鹽堿脅迫下植物的生理響應機制愈加重視，主要集中在蔬菜、農(nóng)作物或特定耐鹽模式植物的研究[5-7]。

許多研究表明，鹽堿脅迫對植物的生理系統(tǒng)影響十分復雜，植株不僅遭受著鹽脅迫引起的滲透傷害和離子毒害，還受到高pH的損害[8]。慈敦偉等[9]通過試驗發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽可以促進花生植株的生長，而高濃度的鹽則會抑制其生長。張曉燕等[10]研究表明，在一定鹽脅迫范圍內(nèi)，文冠果（Xanthoceras sorbifoliaBunge）通過調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓變化，而表現(xiàn)出一定的耐鹽性；此外，郭瑞等[11]研究證明，堿脅迫的高pH值影響植物對礦質(zhì)元素的吸收，阻礙離子穩(wěn)態(tài)重建，顯著影響植物根系生長發(fā)育。因此，鹽堿化植物既要通過滲透調(diào)節(jié)減緩滲透傷害和離子毒害，又要維持體內(nèi)的pH平衡[12-13]。目前，文冠果多以研究雄性不育、遺傳變異、快速繁殖及干旱脅迫等為主，在針對中性鹽和堿性鹽方面的研究鮮有報道。

文冠果是我國特有的珍稀木本油料樹種，被列為制造生物柴油的八大樹種之一，素有“北方油茶”的美稱[14-15]；其根系發(fā)達，萌蘗力強，對環(huán)境具有較強的適應性，在我國華北和東北、西北等地區(qū)均有分布[16]。為避免盲目引種造成的經(jīng)濟損失，研究鹽堿脅迫下文冠果的生理機制顯得尤為迫切。本試驗選用NaCl和Na2CO3模擬河南省鹽堿土壤，研究鹽堿脅迫下其質(zhì)膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶活性等的生理指標，對探究文冠果耐鹽堿能力及耐鹽堿生理響應機制具有重要意義，也為可持續(xù)利用鹽堿地資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在河南牧業(yè)經(jīng)濟學院苗圃（113°65′ E，34°78′ N）進行，2018年1月選用河南濟源種源的文冠果種子進行沙藏處理，2018年3月，將露白的種子直播在規(guī)格為280 mm × 180 mm的花盆內(nèi)，基質(zhì)V草炭土∶V珍珠巖= 5∶1，花盆配置的托盤有效收集其滲出液并及時回澆至盆中，以避免土壤鹽分的流失。將種植的幼苗置于3 m × 3 m的避雨棚下，并在花盆底部作墊高處理，所有植株統(tǒng)一管理。

1.2 鹽堿處理

2019年7月選取長勢良好且基本一致的81株幼苗進行鹽堿處理。將試驗材料隨機分成9份，每份9株，根據(jù)河南地區(qū)常見中性鹽（NaCl）和堿性鹽（Na2CO3）以及Na+濃度[17]，設置NaCl濃度分別為：70、140、210、280 mmol·L-1；Na2CO3濃度分別為：35、70、105、140 mmol·L-1，共8個鹽處理，以澆等體積的清水為對照（CK），每3株為1組，3次重復。各處理每次澆相應濃度的鹽、堿溶液300 mL,為避免鹽激發(fā)生，鹽、堿溶液從低濃度（為最終濃度的1/4）開始加入。每3 d遞增1個梯度，4次后累計澆灌鹽、堿溶液的總量達到設計各處理的濃度，開始計算處理時間。處理后的7、12、17、22 d時采樣進行各生理指標的測定。

1.3 指標測定及方法

采用劉正祥等[18]的方法進行生物量和根冠比的測定；質(zhì)膜透性的測定采用電導儀[19]測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[20]測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法[20]測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[21]測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化學還原法[21]測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計

采用SPSS24.0進行數(shù)據(jù)分析，并用WPS 2019整理以及繪制圖表，進行雙因素方差分析(Twoway ANOVA)檢驗不同濃度、時間和二者交互作用的影響以及單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗不同處理間的差異，LSD法進行多重比較，并對各指標進行相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 鹽堿處理對文冠果生物量的影響

圖1表明：不同鹽濃度下植株的總生物量、根冠比存在差異，隨著鹽堿脅迫加劇，文冠果總生物量呈降低趨勢，而根冠比呈上升趨勢；不同濃度的中性鹽和堿性鹽對植株生長影響不同，280 mmol·L-1的中性鹽和140 mmol·L-1堿性鹽處理下，植株的總生物量最低，根冠比最高。此外，280 mmol·L-1中性鹽和140 mmol·L-1堿性鹽處理比CK的總生物量分別顯著降低79.9%、73.9%（P＜0.05），而根冠比比CK分別顯著增加48.5%、55.4%（P＜ 0.05）。

圖1 鹽堿處理對文冠果幼苗總生物量和根冠比的影響Fig.1 The effect of saline-alkali treatment on biomass production and root-shoot ratio of Xanthoceras sorbifolia seedlings

2.2 鹽堿處理對文冠果幼苗細胞膜系統(tǒng)的影響

由圖2可知：鹽堿處理濃度較低且處理時間較短時，文冠果葉片相對電導率、丙二醛含量均呈上升趨勢，相對電導率顯著高于對照組，在堿脅迫22 d、140 mmol·L-1時，相對電導率開始降低；在NaCl濃度為210 mmol·L-1、Na2CO3濃度為70 mmol·L-1脅迫12 d時丙二醛含量比CK顯著增多，且在NaCl濃度為280 mmol·L-1、Na2CO3濃度為105 mmol·L-1時達最高值；此外，高濃度（NaCl 210、280 mmol·L-1和Na2CO3105、140 mmol·L-1）長時間（17、22 d）的處理下，丙二醛含量呈下降趨勢。說明文冠果具有一定的抗鹽能力，且在高濃度鹽堿脅迫下植物細胞抵御外界逆境的能力增強，但脅迫后期幼苗葉片依舊受害嚴重，甚至使植株死亡。

圖2 鹽堿處理對文冠果幼苗葉片相對電導率和丙二醛的影響Fig.2 The effect of saline-alkali treatment on relative electrical conductivity and Malondialdehyde in the leaves of Xanthoceras sorbifolia seedlings

2.3 鹽堿處理對文冠果幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖3表明：隨著NaCl處理濃度的增加及處理時間的延長，文冠果幼苗葉片脯氨酸及可溶性蛋白含量均呈上升趨勢，在濃度為280 mmol·L-1、處理22 d時達到峰值，分別為30.35 μg·g-1、3.724 mg·g-1，與對照（CK）相比分別增加了211.70%、647.80%。在高濃度（105、140 mmol·L-1）Na2CO3脅迫下，脯氨酸含量隨著時間的延長呈先升后降趨勢，兩濃度處理間差異不顯著（P＞ 0.05），在140 mmol·L-1，處理17 d時達到最大值（26.97 μg·g-1）；可溶性蛋白含量隨處理時間的延長呈上升趨勢，在高濃度（140 mmol·L-1）長時間（22 d）處理下達到峰值（3.765 mg·g-1）。由此說明，鹽堿的類型、濃度及處理時間均對文冠果的生理狀況有一定影響，隨著處理濃度的增加及處理時間的延長，幼苗被破壞程度逐步加深，最終導致植株死亡。

2.4 鹽堿處理對文冠果幼苗SOD活性的影響

由圖4可見：NaCl和Na2CO3處理下的文冠果超氧化物歧化酶（SOD）活性變化規(guī)律基本一致，隨濃度的增大均呈先升后降的趨勢，且表現(xiàn)為堿脅迫＞鹽脅迫；在NaCl濃度為140 mmol·L-1、Na2CO3濃度為105 mmol·L-1處理17 d時SOD活性均達到峰值，比CK分別增加了5.81%、11.95%。

圖4 鹽堿處理對文冠果幼苗葉片SOD活性的影響Fig.4 The effect of saline-alkali treatment on SOD activity in the leaves of Xanthoceras sorbifolia seedlings

2.5 鹽堿脅迫下文冠果幼苗葉片各生理指標的雙因素方差分析

由表1可知：時間和濃度對鹽堿脅迫下的文冠果相對電導率、脯氨酸均有極顯著交互效應(P＜0.01)，而可溶性蛋白僅在鹽脅迫下受到時間和濃度交互作用的影響(P＜ 0.01)。鹽堿脅迫的時間和濃度雙因素對丙二醛和SOD均無顯著的交互作用（P＞ 0.05）。

表1 鹽堿處理下各生理指標的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA of various physiological indexes under saline-alkali treatment

2.6 鹽堿處理下文冠果幼苗葉片各生理指標的相關性分析

由表2可知：NaCl處理下，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白與相對電導率及丙二醛與脯氨酸、可溶性蛋白、SOD均呈極顯著正相關（P＜0.01）；可溶性蛋白與SOD、脯氨酸均呈極顯著正相關（P＜ 0.01）；SOD與相對電導率、脯氨酸無顯著相關(P＞ 0.05）。Na2CO3處理下，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白與相對電導率及丙二醛與脯氨酸、可溶性蛋白均呈極顯著正相關（P＜ 0.01）；SOD僅與丙二醛呈顯著正相關（P＜ 0.05），SOD與相對電導率、脯氨酸、可溶性蛋白無顯著相關(P＞ 0.05）。

表2 鹽堿處理下各生理指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of various physiological indexes under saline-alkali treatment

2.7 鹽堿脅迫處理下文冠果幼苗葉片各生理指標的主成分分析

由表3可看出：NaCl處理下特征值為4.121，累計貢獻率為82.423%，綜合了丙二醛、可溶性蛋白、相對電導率、脯氨酸和超氧化物歧化酶的信息；Na2CO3處理下特征值為3.886，累計貢獻率為77.725%，主要綜合了丙二醛、可溶性蛋白、相對電導率、脯氨酸的信息，具有較好的代表性。因此，可用此5個指標評價文冠果耐鹽性能力[22]。

表3 主成分分析旋轉(zhuǎn)后的成分載荷矩陣Table 3 Principal component analysis rotated component loading matrix

由表4綜合得分[23]可看出：不同濃度NaCl處理對文冠果生理指標的影響由大到小依次為：280、210、140、70、0 mmol·L-1；不同濃度Na2CO3處理對文冠果生理指標的影響由大到小依次為：105、140、70、35、0 mmol·L-1。

表4 NaCl、Na2CO3脅迫下文冠果的綜合得分及排名Table 4 NaCl、Na2CO3 processing the comprehensive score and ranking of the following

3 討論

鹽脅迫產(chǎn)生離子毒害的同時引起次生作用[24]。在鹽堿脅迫下，植物組織離子濃度過高，導致離子失衡，從而引發(fā)植物水分缺失[25]。大量Na+的積累會產(chǎn)生離子毒害[26]，引發(fā)諸如植株生長、光合反應及滲透物質(zhì)等一系列的生理生化反應，最終表現(xiàn)在植物的生長和生物量累積[5,27]。本研究表明，在鹽堿脅迫下，文冠果總生物量呈降低趨勢，根冠比呈上升趨勢，脅迫后期葉片失水萎蔫，變黃干枯，甚至死亡。這可能是植株在調(diào)節(jié)生物量的分配模式[28]來應對脅迫環(huán)境。相對電導率和丙二醛含量可反映植物細胞膜在逆境條件的受損傷程度[29-30]。本研究中，中性鹽70 mmol·L-1處理17、22 d文冠果幼苗的相對電導率略有下降，這可能是低濃度鹽對植物的生長具有促進作用[31]；堿性鹽處理下，相對電導率呈顯著升高趨勢（圖2），說明高濃度堿性鹽會破壞文冠果的細胞膜系統(tǒng)，影響文冠果的生長，該結果與齊琪[32]的研究結論基本一致。在鹽堿脅迫下，時間和濃度2種影響因子對丙二醛無顯著的交互作用（P＞ 0.05）；在鹽堿脅迫后期，高濃度時丙二醛含量呈下降趨勢，這可能與適度脅迫會產(chǎn)生一系列“防衛(wèi)性”生理反應有關，該反應阻礙了傷害的加深，因此，丙二醛含量較低[33]，但隨著脅迫的持續(xù)加重，勢必引發(fā)不可逆的傷害。

脯氨酸、可溶性蛋白的積累是植物在鹽堿脅迫下誘發(fā)的一種防御行為，也是植物遭受逆境脅迫的信號[34]。隨著鹽濃度的增大，脯氨酸和可溶性蛋白含量持續(xù)上升，這表明植物通過脯氨酸、可溶性蛋白調(diào)節(jié)細胞滲透勢，緩解滲透脅迫對植物生長的抑制作用[35]。在堿脅迫下，脯氨酸含量隨堿濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，說明高濃度的Na2CO3處理會破壞文冠果滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。

活性氧（ROS）作為滲透脅迫和離子毒害的副產(chǎn)物，能導致細胞膜功能喪失和細胞的死亡[36]。植物在逆境脅迫下，活性氧代謝加劇體內(nèi)ROS過度積累[37]。脅迫初期，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)被激活，表現(xiàn)為隨處理濃度的增大，文冠果的SOD活性呈先升后降趨勢。本研究中，文冠果幼苗在低濃度鹽堿脅迫下能夠通過提高 SOD 活性增強對活性氧的清除能力；當鹽堿含量過高時，SOD活性下降，致使活性氧清除能力受到抑制，這一結果與林雪鋒等[38]對海濱植物 SOD 活性的研究結論基本一致。除堿性鹽140 mmol·L-1外，隨脅迫時間的延長，植物抗氧化酶活性均持續(xù)升高。在中性鹽處理下，SOD活性升至58 U·g-1·min-1左右保持穩(wěn)定，而堿性鹽SOD活性升至61 U·g-1·min-1左右趨于穩(wěn)定。堿性鹽140 mmol·L-1處理下SOD活性顯著下降表明其已達到閾值，植物體的代謝出現(xiàn)紊亂，活性氧清除機制遭到破壞，酶活性降低，SOD不足以清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧、自由基等[39]。由于華北地區(qū)平均土壤含鹽量在0.3%左右，最高達到1.39%[40]，因此，在園林綠化中，華北平原輕、中度鹽漬化土壤可選擇文冠果應用推廣。

4 結論

綜上所述，鹽濃度在70、140 mmol·L-1，堿濃度在35、70 mmol·L-1時文冠果通過調(diào)節(jié)生物量分配模式，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化酶系統(tǒng)來保護細胞膜系統(tǒng)共同抵御鹽堿脅迫。在高濃度鹽脅迫（210、280 mmol·L-1）、堿脅迫（105、140 mmol·L-1）下，文冠果主要通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御逆境。此外，與中性鹽NaCl相比，高濃度堿性鹽Na2CO3對文冠果的傷害更嚴重。雙因素方差分析顯示：時間和濃度的交互作用對相對電導率、脯氨酸的影響極顯著（P＜ 0.01），且主成分分析和相關性分析表明，丙二醛、可溶性蛋白、相對電導率、脯氨酸、SOD等指標可評價文冠果具有一定的鹽堿耐受性。