迷迭香中抑制NLRP3炎癥小體活性成分的發(fā)現

鐘祥健，周 娜，王 欣，李金杰，劉嘉琛，王楷淇，岳建宇，焦 悅，尚小雅

(北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京100191)

迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)是唇形科迷迭香屬草本植物,原產地為地中海沿岸,目前在我國廣西、海南、云南和福建等省均有引種[1]；具有獨特的香氣,除了可用于烹飪外,也具有豐富的藥用價值[2]。文獻報道迷迭香提取物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經保護、護肝保胃、抗菌、殺蟲等作用[3]；是我國食品添加劑目錄中的一種天然優(yōu)良食用抗氧化劑,能改善食品品質,延長保鮮時間,在醫(yī)藥、護膚品等領域也有廣泛的應用[4]。

炎癥是宿主組織對病原體、異物或損傷的一種防御性反應[5],控制炎癥過程中介質的釋放是抗炎的主要目標[6]。NLRP3炎癥小體是炎癥反應的核心,由凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-1(Caspase-1)等組成的多蛋白復合物,可被尼日利亞菌素(Nigericin)、ATP和病原體等多種因素誘導活化,與癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病密切相關[7]。有研究者提出,通過日常的抗炎飲食(類似地中海飲食),可對一些炎癥性疾病起到預防或緩解作用[8-9]。因此,以食用資源為對象,研究清楚其抗炎活性物質的作用基礎,將抗炎活性組分添加到各種食品中,開發(fā)出能夠長期食用的抗炎功能食品,對于預防或緩解心臟病、癌癥、阿爾茲海默病和糖尿病等慢性疾病中炎癥的發(fā)生發(fā)展,具有重要的實際意義。

目前,研究報道迷迭香提取物對于炎癥反應有很明顯的抑制作用[10]。作為抗炎膳食補充劑,可以改善結腸的炎性癥狀[11]；在大鼠足腫脹實驗中,可以明顯降低體內炎癥因子的表達[12]。研究顯示,迷迭香抗炎活性與其富含的鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等化合物密切相關[13-14]；在脂多糖(LPS)誘導的炎癥細胞模型中,能很好地抑制炎癥因子的產生[15]。但Arranz等[16]研究發(fā)現,鼠尾草酸、迷迭香酸的抗炎活性比粗提物弱,提示：迷迭香中可能存在抗炎活性更強的未知成分。作者所在課題組前期研究發(fā)現,將迷迭香中含量較大的上述已知抗炎成分剔除后,剩余組分仍顯示較好的抗炎活性,與文獻[16]報道一致；同時,液質分析發(fā)現活性組分的主成分不是文獻報道的抗炎活性成分,進一步推測迷迭香中仍存在活性較好、未被挖掘的抗炎活性因子。為明確迷迭香抗炎物質基礎,在體外抗炎活性的篩選結果指導下,對未知抗炎活性組分進行研究,為迷迭香作為抗炎功能食品或膳食補充劑的研發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

迷迭香(Rosmarinus officinalis)原料由哈佛大學醫(yī)學院李豫偉教授鑒定,樣品存于北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室。Sephadex LH-20凝膠：GE公司產品；柱色譜硅膠(160~200目)和薄層色譜(TLC)硅膠GF254：青島海洋化工廠產品；十八烷基硅烷鍵合硅膠(RPC18)：美國Teledyne Isco公司產品。石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇及硫酸等試劑：分析純,北京化學試劑廠產品；高效液相色譜所用色譜級甲醇、乙腈：美國Fisher公司產品；NLRP3和Caspase-1抗體：美國Adipogen公司產品；Caspase-1熒光底物：美國Promega公司產品；細胞培養(yǎng)試劑：美國Gibco公司產品；實驗用超純水：美國Millipore公司產品。

1.2 儀器設備

旋轉蒸發(fā)儀、中壓液相色譜儀：瑞士Buchi公司生產；低壓(Flash)快速分離儀(正反相硅膠制備柱/氰基柱為ISCO公司產品)：Combiflash公司生產；高效液相色譜儀(Sunfire C18制備柱,19 mm×250 mm,5μm；Sunfire C18分析柱,4.6 mm×250 mm,5μm,Waters 2998型檢測器)：Waters公司生產；Million-Q Integral純水系統(tǒng)：德國默克公司產品；Inova 500核磁共振儀：美國Varian公司制造；PromegaGloMax 20/20發(fā)光檢測儀：美國Promega公司生產；Q Exactive Plus高分辨液質聯用分析儀：美國賽默飛公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗炎活性篩選方法的建立及活性篩選

1)小鼠原代骨髓巨噬細胞(BMDMs)的分離培養(yǎng)飼養(yǎng)10～12周齡SPF級雌性C57BL/6雌鼠,取脫臼處死后小鼠的雙側股骨,用細注射器吸取DMEM培養(yǎng)基反復沖出骨髓細胞轉移至50mL離心管,離心去上清液后用體積分數10%胎牛血清(FBS)及1 g/dL雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,同時加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF,終質量濃度為25 ng/mL),培養(yǎng)5天后獲得BMDMs。

2)刺激方式 取分離培養(yǎng)好的BMDMs,用EDTA與胰酶聯合消化后接種于96孔板中,用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,之后將培養(yǎng)基替換成質量濃度50 ng/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基,預處理4 h后,撤除LPS刺激,粗提物以80μg/mL質量濃度處理1 h,單體化合物以10μmol/L濃度處理1 h(模型組中則不需要此步驟),再在實驗孔中加入Nigericin(NLRP3炎癥小體激活劑),刺激45 min。

3)樣品的處理 經過3 500 r/min離心后的細胞培養(yǎng)上清液,加入1/4體積三氯乙酸,放置-20℃冰箱過夜。再經13 000 r/min、4℃條件下離心20 min,棄上清液加冰丙酮洗1次,100℃金屬浴下揮發(fā)干丙酮,后加1×loading buffer 40μL振蕩混合均勻,在水浴中煮沸,冷卻后即為上清液樣品。用PBS洗貼壁細胞3次,置于冰上,每孔加入1×loading buffer 200μL,20 min后刮下細胞,吸取細胞裂解液,在水浴鍋中煮沸15 min,放置冷卻后為細胞裂解樣品。

4)Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay檢測細胞中Caspase-1活性[17]采用Caspase-1活性檢測試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液Caspase-1的活性,檢測方法對照試劑盒說明書進行操作,之后利用PromegaGloMax 20/20發(fā)光檢測儀進行檢測,由Excel進行數據處理。

5)統(tǒng)計學分析 采用SPSS軟件對兩組間數據進行獨立樣本t檢驗,實驗數據以±s表示,與對照組相比,以*P﹤0.05、**P﹤0.01、***P﹤0.001表示差異的顯著性。

1.3.2 提取物的分離、純化與分析

1)原料提取 迷迭香原料10 kg,體積分數100%乙醇預浸12 h,再分別采用體積分數100%、90%和80%乙醇依次超聲提取,每個濃度提取1次,每次1 h,合并提取液減壓濃縮得到浸膏(1.56 kg)。將迷迭香浸膏經水飽和的乙酸乙酯超聲溶解,得到乙酸乙酯相可溶部分和不溶部分。用體外抗炎活性方法進行篩選,發(fā)現抗炎活性集中在乙酸乙酯可溶部分。將乙酸乙酯可溶部分正相硅膠拌樣,用正相常壓硅膠柱色譜分離,以氯仿和甲醇體積比范圍100∶0～0∶100為流動相進行梯度洗脫,利用薄層色譜(TLC)點板檢測,合并相似洗脫流分,得到8個組分(M1—M8)。將分離得到的8個組分進行體外抗炎活性篩選,發(fā)現M1—M6均具有較好的抗炎活性。檢測發(fā)現,熊果酸和齊墩果酸等類似物主要集中在M2組分中,鼠尾草酚和鼠尾草酸等主要集中在M3組分中,活性最好的M5中幾乎不含文獻報道的上述抗炎成分。

2)剩余活性組分的分離 將M5用丙酮加熱超聲溶解,放置析出大量沉淀,母液過Sephadex LH-20凝膠柱色譜,V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1為流動相洗脫,TLC點樣顯色合并,得到6個組分(M5-1至M5-6)。其中M5-2析出黃色沉淀,將其多次過濾純化后,TLC點板顯色為一個黃色斑點,再經制備型高效液相色譜分離純化,流動相為體積分數75%甲醇水溶液,出峰時間為21 min,制備得到化合物1(20 mg)。M5-3經常壓正相硅膠柱分離得到8個組分(M5-3-1至M5-3-8),富集M5-3-3中TLC顯色為黃色的主斑點,分別經Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化,流動相為V(石油醚)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=5∶5∶1。再經制備型HPLC進行純化,流動相為體積分數80%甲醇水溶液,出峰時間分別為15 min和19 min,制備得到化合物2(20 mg)和化合物3(35 mg)。

3)化合物的質譜分析 將分離得到的單體化合物用甲醇溶解,配制成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液,過0.22μm濾膜后直接進行高分辨質譜分析。高分辨質譜條件參數：電噴霧離子源正離子模式,掃描模式為Full MS(m/z：100～500)/dd-MS2,鞘氣流量50 units,輔助氣流量10 units,離子源溫度為380℃,毛細管溫度350℃。分辨率為70 000,碰撞能量為55 V。實驗流程見圖1。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1為黃色無定形粉末。1H-NMR譜的較高場顯示1個甲氧基單峰質子信號δH3.83(3H,s),在低場區(qū)有7個芳環(huán)烯氫信號δH6.32(1H,d,J=1.6 Hz)和6.69(1H,d,J=1.6 Hz),δH6.80(1H,s),δH6.91(2H,d,J=8.7 Hz)和7.91(2H,d,J=8.7 Hz)；13C-NMR譜顯示16個碳信號(圖2),推斷結構是一個甲氧基取代的黃酮。HRESIMS一級質譜顯示m/z：285.07526[M+H]+(理論計算值：285.07575),分子式為C16H13O5；二級碎片離子有270.05176、243.06042、242.05698、213.05431、167.03372、160.05173、145.02831、124.01554、119.04924、111.04424(圖3)；根據碎片離子推測此結構是4′,5-二羥基-7-甲氧基黃酮(圖4)。將該化合物的核磁數據與文獻[18]比對發(fā)現,二者數據一致,故確證了所推導結構的正確性。

圖1 單體化合物分離、純化與分析流程Fig.1 Separation,purification and analyses of monomeric compounds

圖2 化合物1的核磁圖Fig.2 NMR spectra of compound1

化合物2為黃色無定形粉末。1H-NMR譜數據顯示在低場有7個芳環(huán)烯氫質子信號δH6.38(1H,d,J=2.4Hz),6.79(1H,d,J=2.4Hz),7.11(2H,d,J=8.9Hz),8.06(2H,d,J=8.9Hz),6.94(1H,s)；在較高場有2個甲氧基單峰質子信號δH3.85(3H,s)和3.87(3H,s)；13C-NMR譜顯示17個碳信號,其中有2個甲氧基碳信號δC56.3和56.8,和1個羰基碳信號δC182.7(圖5),推斷該物質為黃酮類結構,且有2個甲氧基存在。HRESIMS一級質譜顯示m/z：299.09100[M+H]+(理論計算值：299.09140),分子式為C17H15O5；二級碎片離子有284.06747、256.07257、227.06996、167.03372、146.85710、124.01555(圖6)；根據碎片離子推測此結構是5-羥基-7,4′-二甲氧基黃酮(圖7)。將該化合物的核磁數據與文獻[19]作比較發(fā)現,二者數據一致,故確證了所推導結構的正確性。

化合物3為黃色粉末。1H-NMR譜顯示該化合物存在3個甲氧基單峰質子信號,分別為：δH3.73(3H,s),3.86(3H,s)和3.93(3H,s)；6個烯氫質子信號δH6.94(1H,s),6.95(1H,s),δH7.11(2H,d,J=8.8Hz)和8.07(2H,d,J=8.8Hz)；在13C-NMR譜顯示18個碳信號(圖8),推斷是3個甲氧基取代的黃酮。HRESIMS一級質譜顯示m/z：329.101 44[M+H]+(理論計算值：329.101 96),分子式為C18H17O6；二級碎片離子有313.070 13、296.067 44、285.075 35、269.075 84、268.072 51、253.049 27、240.077 74、225.054 31、169.064 61、154.025 88、136.015 38、133.064 70、132.056 90、108.020 82(圖9)；根據碎片離子推測此結構是5-羥基-7,8,4′-三甲氧基黃酮(圖10)。將該化合物核磁數據與文獻[20]比對發(fā)現,二者數據一致,故確證了所推導結構的正確性。

圖3 化合物1的質譜圖Fig.3 Mass spectra of compound 1

圖4 化合物1的結構式Fig.4 Structure of compound 1

圖5 化合物2的核磁圖Fig.5 NMR spectra of compound 2

圖6 化合物2的質譜圖Fig.6 Mass spectra of compound 2

圖7 化合物2的結構式Fig.7 Structure of compound 2

圖8 化合物3的核磁圖Fig.8 NMR spectra of compound 3

2.2 化合物的核磁波譜數據

化合物1：1H-NMR(DMSO,500 MHz),δH：3.83(3H,s,-OMe-7),6.32(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),6.69(1H,d,J=1.6 Hz,H-8),6.80(1H,s,H-3),6.91(2H,d,J=8.7 Hz,H-3′,5′),7.91(2H,d,J=8.7 Hz,H-2′,6′),12.94 (1H,s,OH-5)；13C-NMR(DMSO,125 MHz),δC：56.0(-OMe-7),92.6(C-8),97.9(C-6),102.9(C-3),104.7(C-10),115.9(C-3′,5′),121.1(C-1′),128.6(C-2′,C-6′),157.2(C-5),161.2(C-9),161.3(C-2),164.0(C-4′),165.1(C-7),181.9(C-4)。

化合物2：1H-NMR(DMSO,500 MHz),δH：3.85(3H,s,-OMe-4′),3.87(3H,s,-OMe-7),6.38(1H,d,J=2.4Hz,H-6),6.79(1H,d,J=2.4Hz,H-8),6.94(1H,s,H-3),7.11(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,H-5′),8.06(2H,d,J=8.8Hz,H-2′,H-6′),12.92(1H,s,OH-5)；13C-NMR(DMSO,125 MHz),δC：56.3(-OMe-4′),56.8(-OMe-7),93.5(C-8),98.8(C-6),104.4(C-3),105.4(C-10),115.3(C-3′,C-5′),123.4(C-1′),129.1(C-2′,C-6′),157.9(C-9),161.9(C-4′),163.1(C-5),164.3(C-2),165.9(C-7),182.7(C-4)。

圖9 化合物3的質譜圖Fig.9 Mass spectra of compound 3

圖10 化合物3的結構式Fig.10 Structure of compound 3

化合物3：1H-NMR(DMSO,500 MHz),δH：3.73,(3H,s,-OMe-4′),3.86(3H,s,-OMe-7),3.93(3H,s,-OMe-8),6.94(1H,s,H-3),6.95(1H,s,H-6),7.11(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,H-5′),8.07(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′,H-6′),12.89(1H,s,OH-5)；13C-NMR(DMSO,125 MHz),δC：55.6(-OMe-4′),56.5(-OMe-7),60.1(-OMe-8),91.7(C-6),103.4(C-3),105.2(C-10),114.6(C-3′,5′),122.7(C-1′),128.3(C-2′,C-6′),131.9(C-8),152.1(C-9),152.7(C-5),158.7(C-7),162.4(C-4′),163.6(C-2),182.3(C-4)。

2.3 抗炎活性篩選結果

通過模型組與空白組對比可以看出,當給細胞加入炎癥小體激活劑Nigericin后,可以明顯刺激炎癥小體的活性,提示造模成功。當已知陽性藥物MCC950以10μmol/L濃度處理細胞后,可以明顯抑制Nigericin誘導炎癥小體的活性。以上說明實驗體系成功,可以用于評價其他化合物對炎癥小體的影響。將乙酸乙酯相、乙酸乙酯相經正相硅膠分離后的不同組分及單體化合物進行體外抑制Nigericin誘導的炎癥小體模型抗炎活性篩選,結果見圖11。

對粗提物的活性測試結果顯示,乙酸乙酯相以80μg/mL質量濃度處理細胞后,相對炎癥小體活力為0.643 3,顯示一定的抗炎活性。經正相硅膠分離后的不同部位同樣以80μg/mL質量濃度處理細胞,M5組分的相對炎癥小體活力為0.610 6,顯示最好的抗炎活性,因此選擇此部位進行下一步的分離純化。

在抗炎活性篩選中,單體化合物和陽性藥物MCC950一樣以10μmol/L濃度處理細胞。陽性對照MCC950的相對炎癥小體活力為0.311 2,而化合物1為0.331 2,比迷迭香中已知的鼠尾草酚和鼠尾草酸具有更強的抗炎活性,且顯示活性與陽性對照組相當。

圖11 抗炎活性篩選結果Fig.11 Results of anti-inflammatory activities screening

3 結語

炎癥反應涉及腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病等疾病的病理過程,在安全有效的前提下抑制炎癥反應,對于炎癥性相關疾病的預防與改善具有重要意義。有較多文獻報道了迷迭香提取物抗炎活性及安全性評價,發(fā)現主要抗炎活性成分是鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等[13,16]。作者將迷迭香中已知的抗炎活性成分剔除后,利用Nigericin誘導的炎癥小體模型進行活性篩選,通過核磁和高分辨質譜數據確證結構,首次從迷迭香中發(fā)掘具有抗炎活性的3個黃酮類化合物,且化合物1(4′,5-二羥基-7-甲氧基黃酮)的抗炎活性與陽性對照組相當,為迷迭香作為改善炎癥發(fā)展的功能食品或膳食補充劑提供理論依據。

作者所在課題組前期對活性粗提物用液質聯用分析后發(fā)現,仍存在未被挖掘的其它類型抗炎活性因子。因此,還需對迷迭香活性部位繼續(xù)進行深入、系統(tǒng)研究,以期發(fā)現更多強抗炎活性的結構,為開發(fā)應用迷迭香作為預防或改善相關慢性疾病炎癥反應的功能食品提供更多的理論支撐和檢測依據。