黃曲霉菌的差異揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及其代謝途徑分析

黃海游，胡 昊，李淑軍，鐘讀波，胥志祥，孫磊業(yè)，韓豐霞

(1.昆明理工大學 環(huán)境科學與工程學院,云南 昆明650500；2.云南大學 科技咨詢發(fā)展中心,云南 昆明650000；3.云南云測質(zhì)量檢驗有限公司,云南昆明650000；4.昆明理工大學創(chuàng)新發(fā)展研究院,云南昆明650000)

世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization,WHO)公告指出每年發(fā)生的食源性疾病達數(shù)10億例；發(fā)達國家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病,其中約有170萬15歲以下的兒童因食源性微生物污染引起腹瀉而死亡[1]。據(jù)調(diào)查,我國2010—2014年,食源性疾病暴發(fā)案例有2 000多起,發(fā)病人數(shù)約有63 000人,其中死亡人數(shù)約有970人,而微生物引起食源性疾病暴發(fā)案例有41.1%,其中微生物病原菌是引起食源性疾病暴發(fā)的主要原因[2]。黃曲霉的污染不僅對人的健康造成巨大傷害,而且對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成巨大損失[3]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織報道,全球每年約有2%的農(nóng)作物因為受霉菌污染而失去利用價值[4]。

代謝組學以小分子生物標志物為研究對象,相較于大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸),其研究更快速和準確,因此在不同學科領域作為快速檢測方法被加以開發(fā)和應用。其中,環(huán)境中物質(zhì)的變化可通過介導微生物代謝使微生物對環(huán)境變化產(chǎn)生持續(xù)反應[5]。同樣地,不同食品中微生物代謝物的變化也能反映出微生物處于在不同環(huán)境(食品)中的變化。黃光琦等[6]研究指出,黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1)通過與tRNA結(jié)合形成加成物(B-tRNA),降低tRNA與某些氨基酸結(jié)合的活性,從而抑制必需氨基酸(如賴氨酸,亮氨酸,精氨酸和甘氨酸)與tRNA的結(jié)合,最終在翻譯水平上干擾了蛋白質(zhì)生物合成,影響了細胞的正常代謝。Lee等[7]在2015年通過代謝組學分析方法發(fā)現(xiàn)了黃曲霉中新的四肽和抗炎代謝產(chǎn)物。謝華里等[8]利用非靶標代謝組學研究了溫度對黃曲霉代謝的影響,發(fā)現(xiàn)溫度影響多個代謝途徑,且曲酸和黃曲霉毒素的累積變化規(guī)律相似。然而,大分子物質(zhì)檢測的滯后性導致不能提前預防黃曲霉菌產(chǎn)生的潛在健康問題?；诖?作者從小分子代謝物入手,通過尋找食物污染早期的差異性代謝物,為食品安全預防和檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐干作為一種常見的休閑零食和佐餐佳品,其食品原材料和加工過程都極易被微生物污染[9],因此從豆腐干入手研究黃曲霉菌在豆腐干中的差異性代謝物。

黃曲霉菌(CGMCC 3.6431)：購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)；即食豆腐干：購自某超市(主要成分為大豆,水,植物油,食用鹽,釀造醬油,紅糖,芝麻,香辛料,谷氨酸鈉,食用香精,雙乙酸鈉,乙基麥芽酚,5’呈味核苷酸二鈉,氯化鎂)。乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)：美國西格瑪公司產(chǎn)品；二氯甲烷(色譜純)：美國邁瑞達公司產(chǎn)品；液體察氏培養(yǎng)基：百思生物公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890N-5975C)：美國安捷倫公司產(chǎn)品,并配自動進樣器(A7683B)、MSD化學工作站和NIST 14.0數(shù)據(jù)庫；固相微萃取頭(75μm CAR-PDMS)：美國色譜科公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(Allegra X-15R)：美國貝克曼公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(FDU-1200)：日本東京理化公司產(chǎn)品；試管分散機(UTTD)：德國艾卡公司產(chǎn)品；滅菌鍋(BXM-30R)：上海博訊公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(MJ-70-I)：上海一恒公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌體準備 將-80℃保藏的1 mL菌液加入200 mL察氏培養(yǎng)基中,在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩(150 r/min)培養(yǎng)5 d。將豆腐干和超純水以質(zhì)量比1∶10的比例加入滅菌攪拌機里,打碎10 min,制作成豆腐干液體培養(yǎng)基。取培養(yǎng)好的1 mL菌液加入200 mL豆腐干培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)黃曲霉菌5 d。

1.3.2 代謝物提取 取上述樣品10 g于50 mL離心管中,迅速加入10 mL的-40℃冷甲醇溶液(體積分數(shù)60%)[10-12],振蕩混勻后置于-80℃冰箱中冷凍12 h進行淬滅。

將淬滅后的冰凍樣品放于冷凍干燥機中進行凍干,凍干后的樣品再加入10 mL乙腈、甲醇和水的混合溶液(體積比為2∶2∶1)[13-15],振蕩后將溶液倒入帶有3種規(guī)格玻璃球的液體均質(zhì)器中破碎10 min。將破碎后的樣品置于37℃培養(yǎng)箱中2 h,進行代謝物的提取。

將反應后的溶液離心15 min(-4℃、10 000 r/min),取出上清液,置于-80℃冰箱中凍藏12 h,再將冰凍樣品進行冷凍干燥。在GC-MS應用中,一種是測定生物體自然產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物,一種是需要衍生化的代謝物。為了保存更多更原始的物質(zhì),選擇測定其自然狀態(tài)下的揮發(fā)性代謝物,不作衍生化處理。進樣前,加入2 mL二氯甲烷溶解,混勻,然后上機測樣。

1.3.3 頂空固相微萃?。℉S-SPME）揮發(fā)性代謝物取10 mL培養(yǎng)5 d后的豆腐干混合液加入到頂空瓶中,用密封橡膠墊封死,待萃取。

將75μm CAR PDMS固相微萃取頭刺入頂空瓶中,在離液面2 cm處進行30 min(40℃)萃取。萃取結(jié)束后立即手動上機檢測。

1.3.4 GC-MS條件 DB-624毛細管色譜柱(60 m×320μm×1.80μm)；載氣：高純氦氣；流速：2.0 mL/min；柱溫升溫程序：初始溫度40℃,保持6 min,然后以10℃/min升溫至230℃,保持10 min。自動進樣1.0μL；采用不分流模式；進樣口溫度230℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃；接口溫度230℃；全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍29~350m/z。

1.4 真菌基因組測序

利用目前使用最廣泛的二代測序平臺Illumina Hiseq×10平臺,對質(zhì)檢合格的DNA樣品構(gòu)建插入片段為約400 bp的片段,進行PE150(pair-end)測序,即雙端測序,單端測序讀長150 bp,每個樣品提供不低于基因組100×覆蓋深度的原始測序數(shù)據(jù)量；真菌基因組精細圖,采用“二代+三代”的測序模式,對同一樣品分別提供≥100倍PE150數(shù)據(jù)和≥80倍的三代數(shù)據(jù),基于所獲得的測序數(shù)據(jù)進行一系列分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去噪和歸一化后整理成Excel表,通過NIST 14.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對確認各物質(zhì)。利用峰面積通過SIMCA 14.1進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析,選取VIP值大于1的物質(zhì)作為潛在的差異物,根據(jù)分子量小、相對產(chǎn)量高、代謝重要性強的原則選取深入分析的代謝物。基因組序列信息通過KEGG genes和KEGG LIGAND數(shù)據(jù)庫比對,進行分類和整理,使用Gephi軟件構(gòu)建代謝網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS測定結(jié)果

圖1從下往上分別為6個豆腐干培養(yǎng)基樣品總離子流(TIC)圖和12個接種黃曲霉菌的豆腐干培養(yǎng)基總離子流圖,只有在保留時間25.194 min時有明顯的差異,是接種黃曲霉菌的樣品中(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸甲酯獨有的峰。

圖1 豆腐干培養(yǎng)基(CBDB)和接種黃曲霉菌的豆腐干培養(yǎng)基(CBDHQ)總離子流疊放圖Fig.1 Total ion chromatogram stacking map of dried bean curd medium and dried bean curd medium inoculated with Aspergillus flavus

圖2是頂空固相微萃取實驗的總離子流疊放圖,從下往上分別為3個豆腐干培養(yǎng)基樣品總離子流(TIC)圖和3個接種黃曲霉菌的豆腐干培養(yǎng)基總離子流圖。分析可知,乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-丁醛、1-戊烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、7-[2-(4-甲氧基苯基)乙烯基]-2-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶是接種了黃曲霉的樣品中獨有的揮發(fā)性物質(zhì)。需要通過判別模型結(jié)合自然揮發(fā)特征物質(zhì)來整理差異代謝物的代謝途徑。

圖2 頂空固相微萃取實驗的豆腐干培養(yǎng)基(CBDB)和接種黃曲霉菌的豆腐干培養(yǎng)基(CBDHQ)總離子流疊放圖Fig.2 Total ion chromatogram stacking map of dried bean curd medium and dried bean curd medium inoculated with Aspergillus flavus in headspace solid phase microextraction

利用檢測所得的各物質(zhì)的歸一化峰面積建立模型,主成分分析(PCA)使得由m個樣品和m×n個物質(zhì)峰面積組成的n維矩陣降維到一個平面空間內(nèi),將最具差異的影響因子方向作為主成分。主成分分析也是代謝組學中最常用的分析方法[16]。從圖3(a)可知,豆腐干培養(yǎng)基(CBDB)和接種黃曲霉菌5 d的豆腐干培養(yǎng)基(CBDHQ)在主成分分析模型上有非常明顯的區(qū)別,說明兩組樣品的檢出物有著明顯的差異。

圖3 豆腐干培養(yǎng)基(CBDB)和接種了黃曲霉菌的豆腐干培養(yǎng)基(CBDHQ)代謝物主成分分析得分圖與正交偏最小二乘判別得分圖Fig.3 Principal component analysis score map and orthogonal partial least squares discriminant score map of dried bean curd medium and dried bean curd medium inoculated with Aspergillus flavus

偏最小二乘判別方法(PLS-DA)是一種有監(jiān)督的分類程序,其中類成員信息用于建立判別模型,因此可用于識別最能鑒別樣品組的化合物。作為代謝組學常用的分析方法,2002年Trygg和Wold[17]把PLS算法升級為正交偏最小二乘法(OPLS),OPLS更易于看出兩組之間的差異[18]。SIMCA將OPLS-DA也作為了軟件14.1版的分析功能。VIP值(投影的可變重要性)總結(jié)了變量在解釋X和Y相關時的重要性,大于1的VIP值表示重要的X變量,低于0.5的值表示不重要的X變量。1到0.5之間的間隔是灰色區(qū)域,其中重要性級別取決于數(shù)據(jù)集的大小。本研究的OPLS-DA模型見圖3(b),模型中R2Y=0.954,Q2=0.755,說明模型有很好的穩(wěn)定性和預測性。VIP預測值大于1的物質(zhì)有1,2,3-三甲基-苯、均三甲苯、乙醇、十六烷酸甲酯、2,4-二叔丁基苯酚、乙酸、三氯甲烷、1-丁醇、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯。

2.2 黃曲霉菌基因組測定結(jié)果

基因組全長37 687 868 bp,GC含量為48.2%。共編碼13 897個基因,包含10 949個功能基因、272個tRNA基因、43個rRNA基因和2 633個未知基因。在KEGG基因分類系統(tǒng)中,具體的信號通路相關基因有576個；代謝相關基因有2 514個；人類疾病相關基因有787個；遺傳信息處理相關基因有788個；組織系統(tǒng)相關基因有555個；環(huán)境信息處理相關基因有337個。

為了更清晰地表達黃曲霉菌的代謝信息,利用Gephi軟件建立黃曲霉菌的代謝途徑關系網(wǎng)絡圖,見圖4,箭頭所指方向為代謝正向,圖中每個點代表一個代謝途徑,點的大小代表與該代謝途徑相關的代謝途徑的數(shù)量。對于黃曲霉菌,大部分的基因表達是關于基礎代謝(占代謝途徑總數(shù)的35.47%)的,且大部分其它代謝途徑受基礎代謝的影響。其中,代表MAPK信號通路的點在非基礎代謝點中最大,表明該通路影響和被影響的代謝途徑很多。

乙酸的代謝途徑見圖5。乙酸在?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑中由乙酰磷酸酯經(jīng)乙酸激酶(ACK)產(chǎn)生。它在丙酮酸代謝中由乙酰輔酶A在乙酰輔酶A合成酶(ACS)作用下產(chǎn)生,也能在乙酰輔酶A合成酶(ACS)或乙醛脫氫酶ALDH(NAD+)作用下由乙醛產(chǎn)生；由乙酰磷酸酯在乙酸激酶(ACK)或?；姿崦?ACYP)作用下產(chǎn)生。乙酸在甲烷代謝途徑中由乙酰輔酶A在乙酰輔酶A合成酶(ACS)作用下產(chǎn)生；由乙酰磷酸酯經(jīng)乙酸激酶(ACK)產(chǎn)生。乙酸主要參與了丙酮酸代謝、糖酵解過程、甲烷代謝過程,它作為乙酰輔酶A的中間產(chǎn)物,極大地影響了黃曲霉毒素的合成[19]。糖酵解過程主要影響了三羧酸循環(huán)(TCA cycle),淀粉和蔗糖代謝,戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化的過程；?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑主要影響了氰基氨基酸代謝和谷胱甘肽代謝；丙酮酸代謝主要影響了甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸合成和代謝,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成,糖酵解和糖異生過程,三羧酸循環(huán),丁酸代謝,酮體的合成與降解,賴氨酸的合成,脂肪酸的合成和烯二炔類抗生素的生物合成；乙酸參與的乙醛酸和二羧酸代謝影響了丙酮酸代謝,三羧酸循環(huán)和糖酵解過程；甲烷代謝過程影響了硫代謝,甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝,戊糖磷酸途徑和乙醛酸、二羧酸代謝。

乙醇是在糖酵解途徑中由丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸,乙酸轉(zhuǎn)化為乙醛,乙醛再經(jīng)乙醇脫氫酶(ADH1)產(chǎn)生乙醇的代謝途徑產(chǎn)生,其主要影響三羧酸循環(huán),淀粉和蔗糖代謝,戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化過程。1-丁醇只由丁醛在丁醇脫氫酶(BDH)的作用下生成,影響丙酮酸代謝,三羧酸循環(huán)和維生素B6的代謝。2-甲基-1-丙醇、1-戊烯-3-醇可能是在丙酸代謝中衍生出來的產(chǎn)物,與NAD+的脫氫作用有關；2-甲基-丁醛和3-甲基-1-丁醇猜測與丁酸代謝中丁醇脫氫酶(BDH)的作用有關；1,2,3-三甲基-苯、均三甲苯、2,4-二叔丁基苯酚、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯猜測可能與芳香族化合物代謝有關。其中,乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-丁醛、1-戊烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇可作為今后判斷黃曲霉污染的潛在特征氣味物質(zhì)。

3 結(jié) 語

通過代謝組學研究方法更清晰地區(qū)分被黃曲霉污染的豆腐干,并通過模型計算出差異性代謝物1,2,3-三甲基-苯、均三甲苯、乙醇、十六烷酸甲酯、2,4-二叔丁基苯酚、乙酸、三氯甲烷、1-丁醇、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯。作者結(jié)合代謝組學和基因組信息,通過對代謝網(wǎng)絡的構(gòu)建,明確了乙酸、乙醇和1-丁醇在黃曲霉菌代謝網(wǎng)絡中的代謝過程和作用。乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-丁醛、1-戊烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇也可作為黃曲霉菌的特征性揮發(fā)物質(zhì)。此研究對今后建立快速檢測黃曲霉污染的方法有著積極的意義。

圖4 黃曲霉菌代謝網(wǎng)絡圖Fig.4 Metabolic network map of Aspergillus flavus

圖5 黃曲霉菌中乙酸參與的代謝途徑網(wǎng)絡Fig.5 Metabolic pathway network of acetic acid in Aspergillus flavus