CHO細胞Kcmf1基因內定點整合ZsGreen1報告基因的表達穩(wěn)定性研究

楊 蕾，丁學峰，蔡燕飛，陳 蘊，龔笑海，段作營，李華鐘，金 堅*

(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫214122；2.江南大學 藥學院,江蘇 無錫214122)

中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞作為生物技術藥物生產細胞的優(yōu)勢地位已經明確,且構建適于穩(wěn)定生產治療性生物制品的CHO工程細胞系一直是研究工作的熱點[1-2]。經典的CHO工程細胞系構建均是采用目的基因隨機整合,多輪單克隆篩選,挑選相對穩(wěn)定表達目的蛋白細胞株的方法[3-4]。帶來的麻煩是構建工作費時費力,更重要的是無法知曉高、低表達目的蛋白的原因。隨著主細胞庫到生產細胞庫的放大和生產過程傳代,目的蛋白的表達量極易變化,丟失了目的蛋白表達的非生產性細胞克隆持續(xù)增加,難以達到生產和監(jiān)管的要求。構建定點整合的穩(wěn)定表達外源基因的CHO工程細胞系是理論上解決這些問題的有效方法。CHO細胞的一、二和三代基因測序結果均已相繼公布,相關品系的CHO細胞染色體變異很大。對已保有的各種生產治療性生物制品的高、低表達CHO細胞株,結合其整合位點和臨近區(qū)域的結構分析,還未有成功地將CHO細胞的穩(wěn)定高表達整合位點用于建立生產型CHO工程細胞系的報道[5-7]。

作者前期以CHO-K1為出發(fā)細胞株,組合應用慢病毒示蹤報告基因技術和染色體步移技術,尋找到了可以持續(xù)表達綠色熒光標簽的基因組內位點。測序結果明確了該整合位點為NW_003614172.1第629890堿基處,位于鉀通道調節(jié)因子1(potassium channel modulatory factor 1,Kcmf1)基因內部的一段非編碼區(qū)域。該基因編碼鋅指蛋白,參與鉀通道的調節(jié)[8-9]。以此為基礎,構建和單克隆化了以Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處定點整合ZsGreen1報告基因的CHO-K1細胞(2C3),對其作為工程細胞的穩(wěn)定性開展了系統(tǒng)評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 中國倉鼠卵巢細胞亞株CHO-K1,購自美國ATCC公司；2C3細胞,為染色體NW_003614172.1內第629890號堿基處整合了ZsGreen1基因的CHO-K1細胞株,由作者所在課題組構建和保存[9]。

1.1.2 主要試劑 Ham's F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司產品；M2、M4無血清基礎培養(yǎng)基：蘇州康聚生物技術公司產品；PCR試劑：南京諾唯贊生物科技有限公司產品；TRIzol試劑：美侖生物公司產品；反轉錄試劑盒、SYBR?Green Master Mix：Takara公司產品；DEPC水、基因組DNA小量抽提試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。實驗中所用引物序列見表1。

表1 PCR引物列表Table 1 List of PCR primers

1.1.3 儀器與設備 細胞培養(yǎng)箱SeriesⅡWater Jacket、NANODROP 2000：美國Thermo Fisher公司產品；倒置熒光顯微鏡、倒置式生物顯微鏡TE2000-S：日本NIKON公司產品；流式細胞儀、流式分選儀BD FACSAriaIII：美國BD公司產品；酶標儀infinite M200 PRO、凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi：上海天能公司產品；核酸電泳儀Mini-Protean、PCR儀C1000和Q-PCR儀CFX96：美國伯樂公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CHO-K1細胞和2C3細胞在完全培養(yǎng)基(Ham's F-12K+體積分數10%FBS)內連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,體積分數5%CO2。

先后采用了兩種方法對2C3細胞進行懸浮馴化：第一種是使用無血清基礎培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)直接替換完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞,第二種是使用無血清基礎培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)逐步取代完全培養(yǎng)基,使培養(yǎng)基中血清的最終體積分數也逐步遞減,梯度為10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0%,每個梯度連續(xù)傳代培養(yǎng)2~3次,當細胞生長狀態(tài)良好時減為另一梯度。

細胞馴化成功后,在150 mL搖瓶中使用無血清基礎培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)懸浮傳代培養(yǎng),培養(yǎng)基為30 mL,恒溫搖床上的培養(yǎng)條件為110 r/min、37℃、體積分數5%CO2。每天取樣計數,調整細胞接種密度為1.0×106個/mL。

1.2.2 MTT法檢測2C3貼壁細胞的倍增時間 將T75培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細胞用胰蛋白酶消化后計數,用新鮮的完全培養(yǎng)基將細胞稀釋至1×104個/mL,吹打混勻后按每孔2 500個細胞接種到96孔板中,5個重復孔,共接種10塊相同的96孔板,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天,取出一塊96孔板,避光加入MTT,每孔10μL,4小時后加入MTT Buffer,每孔100μL,過夜反應后用酶標儀測取560 nm波長下的吸光值。之后9天內,在每天相同時間點取一塊板重復上述操作,依據測得的吸光值繪制出細胞的生長曲線。

1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1蛋白表達情況 貼壁細胞每分裂倍增10次,細胞匯合度達50%~60%時,倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1蛋白表達情況,隨機選擇鏡下視野進行明場和熒光場拍攝。每次拍攝條件一致,AECompensation為+0.0 EV,Exposure Time為1 s,Gain為4×,Contrast為Linear,熒光場照片采用ImageJ軟件分析細胞的平均熒光強度。

按血清終濃度遞減的方法懸浮馴化的細胞(2C3-M2M4+體積分數0%FBS),每次降低血清含量時觀察ZsGreen1蛋白表達情況；直接使用無血清基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞(2C3-M2M4),待細胞轉至搖瓶培養(yǎng)時初次觀察。馴化成功后的懸浮2C3細胞,每分裂倍增10次進行觀察,拍攝條件及分析方法與貼壁細胞相同。

1.2.4 流式細胞分析儀檢測細胞平均熒光強度貼壁細胞每分裂倍增10次后取出部分細胞進行凍存,儲存于液氮罐中。在細胞總倍增次數達到50次時,同時復蘇之前凍存的所有不同代次的細胞,傳代培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)良好,使用流式細胞分析儀檢測細胞的平均熒光強度,檢測結果使用FlowJo 7.6.2軟件進行分析。

懸浮細胞在馴化成功后每分裂倍增10次進行流式分析,檢測時和貼壁細胞使用同一條件,數據分析方法相同。

1.2.5 流式細胞分選儀分選懸浮細胞池 分析懸浮馴化成功的2C3細胞池,發(fā)現(xiàn)細胞池中的細胞表達ZsGreen1蛋白的熒光強度有一定的差異。以未插入外源基因的CHO-K1細胞為陰性對照,收集10 000個細胞測定對照組細胞熒光強度,確定103為陰、陽性細胞分界線：單細胞FITC-A熒光強度低于103時為陰性細胞,高于103時為陽性細胞。流式細胞分選儀對2C3細胞池進行分選,收集陰性細胞1.2×106個,分成四組分別培養(yǎng)在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham's F-12K、Ham's F-12K+10%FBS四種培養(yǎng)基中(M2∶M4體積比為1∶1)；收集熒光強度值最高的10%陽性細胞3×105個,使用無血清基礎培養(yǎng)基擴培。

1.2.6 2C3細胞中ZsGreen1基因的分析 使用基因組DNA小量抽提試劑盒,分別提取在無血清基礎培養(yǎng)基里擴培后的陰性、陽性細胞的基因組,使用表1中ZsGreen1-F.1和ZsGreen1-R.1引物進行PCR擴增,反應體系為：2×Phanta?Max Buffer 12.5μL,dNTPMix 0.5μL,ZsGreen1-F.1(10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.1(10μmol/L)1μL,Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL,DNA 100 ng,ddH2O補足25μL。擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

1.2.7 2C3細胞中ZsGreen1基因轉錄水平分析分別提取在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham′s F-12K、Ham′s F-12K+10%FBS四種不同培養(yǎng)基中擴培的陰性細胞的RNA,將其反轉錄成cDNA,反轉錄體系 為：5×PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time)4μL,Total RNA 1μg,RNase Free dH2O補足20μL。輕柔混勻后使用PCR儀進行反轉錄反應,反應條件為：37℃,15 min；85℃,5 s；降溫至4℃,于-20℃長期保存。反轉錄得到的cDNA產物進行Q-PCR,反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μL,ZsGreen1-F.2 (10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.2(10μmol/L)1μL,cDNA 10 ng,ddH2O補足20μL。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s,60℃延伸30 s,40個循環(huán)；溶解曲線為65℃反應5 s,95℃反應60 s。

2 結果與分析

2.1 2C3細胞倍增時間檢測結果

用MTT法檢測560 nm波長下的吸光值,繪制出的細胞生長曲線見圖1。CHO細胞一般20~24 h分裂一次,定點整合ZsGreen1報告基因的CHO-K1細胞(2C3)的倍增時間與CHO-K1細胞大體一致,分裂倍增時間按24 h計,即每1天細胞發(fā)生1次倍增,記做細胞傳代1次。

圖1 2C3細胞生長速率Fig.1 Growth rate of 2C3 cells

2.2 貼壁培養(yǎng)的2C3細胞表達ZsGreen1蛋白情況

為了驗證位點NW_003614172.1表達外源基因的穩(wěn)定性,作者持續(xù)觀察2C3細胞連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)過程中ZsGreen1蛋白的表達情況。前期對此細胞已進行了20代傳代實驗,發(fā)現(xiàn)熒光蛋白可以持續(xù)表達[10]?；趶纳a細胞庫擴增到大生產罐需要45~50代次的實際狀態(tài),本實驗設計以傳至20代的2C3細胞為初始細胞,連續(xù)傳代50次為實驗終點,觀察目的基因的表達情況,進行穩(wěn)定性評估。具體實驗為,每傳10個代次,用倒置熒光鏡觀察并拍照記錄,見圖2(a),熒光場照片使用ImageJ軟件分析細胞的平均熒光強度,見圖2(b)。同時,傳代過程中每傳代10次進行一次細胞凍存,在連續(xù)傳代50次后,復蘇之前凍存的不同代次的細胞,使用流式細胞儀進一步對熒光蛋白的表達情況進行定量分析,見圖2(c)、(d)。倒置熒光顯微鏡的觀察結果和流式細胞儀分析結果皆顯示,在連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)50代的過程中,100%的2C3細胞可以穩(wěn)定表達ZsGreen1報告基因。

2.3 懸浮培養(yǎng)的2C3細胞表達ZsGreen1蛋白情況

治療性生物制品的原料藥生產基本采用懸浮細胞大規(guī)模生產,所以在驗證了貼壁培養(yǎng)的2C3細胞表達ZsGreen1蛋白的穩(wěn)定性后,對其進行了懸浮馴化。先采用無血清基礎培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基的方法馴化2C3細胞。當細胞生長狀態(tài)良好,大小均一,數量能隔天翻倍時,認為其馴化成功,開始進行無血清基礎培養(yǎng)基懸浮傳代培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細胞表達ZsGreen1蛋白熒光強度較培養(yǎng)基中含血清時有明顯差異,細胞平均熒光強度降低。為了判斷此現(xiàn)象是否因直接更換培養(yǎng)基引起的細胞不適應導致,作者采用了第二種懸浮馴化方法,使培養(yǎng)基中血清終濃度逐步遞減,但是馴化成功后觀察到了同樣的實驗結果：細胞平均熒光強度較培養(yǎng)基中含血清時有明顯差異。

對兩種方法馴化成功的細胞連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)30、60 d后,倒置熒光顯微鏡均觀察到細胞平均熒光強度有所提高,見圖3,同時使用流式細胞儀對不同代次的懸浮細胞表達熒光蛋白的情況進行檢測,使用FlowJo 7.6.2軟件分析檢測結果,見圖4。以CHO-K1細胞為對照,通過連續(xù)傳代培養(yǎng)后,表達熒光蛋白的細胞數目增多,陽性細胞比例有了12%~15%的提升。

與此同時,作者發(fā)現(xiàn)當懸浮培養(yǎng)使用的無血清基礎培養(yǎng)基中加入體積分數10%血清后,懸浮細胞池中表達熒光蛋白的細胞比例明顯提升,95%以上的細胞能夠表達ZsGreen1報告基因,見圖5。

圖2 貼壁傳代培養(yǎng)的2C3細胞表達ZsGreen1蛋白情況Fig.2 Expression of ZsGreen1 protein by adherently subcultured 2C3 cells

圖3 懸浮傳代培養(yǎng)的2C3細胞表達ZsGreen1蛋白情況Fig.3 Expression of ZsGreen1 protein in suspension-cultured 2C3 cells

2.4 ZsGreen1蛋白的DNA水平驗證

為了確認流式分析儀檢測到的陰性細胞是否在細胞分裂過程中丟失了ZsGreen1基因,采用流式細胞術從直接更換培養(yǎng)基的方法中馴化成功的2C3細胞分選細胞,以未插入外源基因的CHO-K1為對照,以FITC-A熒光強度值103為陰性和陽性細胞的分界,分別收集細胞,見圖6。

以分別回收的1.50×106個熒光蛋白表達陰性和陽性細胞為材料,分別提取基因組,PCR擴增ZsGreen1基因,瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結果見圖7,測序結果見表2。結果顯示,陰性和陽性細胞群基因組內均含有ZsGreen1基因,說明蛋白表達的差異是細胞從貼壁培養(yǎng)到適應懸浮培養(yǎng)的過程中受到影響的結果。

圖4 流式細胞儀分析2C3細胞表達熒光蛋白情況Fig.4 Flow cytometry analysis of the expression of fluorescent protein in 2C3 cells

圖5 無血清基礎培養(yǎng)基中添加體積分數10%胎牛血清后2C3細胞表達ZsGreen1蛋白的情況Fig.5 Expression of ZsGreen1 protein in 2C3 cells supplemented with 10%FBSin serum-free basal medium

圖6 流式分選儀分選2C3細胞示意圖Fig.6 Schematic diagram of sorting 2C3 cells by flow sorter

圖7 2C3細胞流式分選后陰性細胞池ZsGreen1基因驗證Fig.7 Verification of the ZsGreen1 gene in the negative cell pool after 2C3 cell flow sorting

為了驗證上文提到的血清的作用,將回收的陰性細胞以3×105個/孔接種在六孔板內,使用M2M4、M2M4+10%FBS、F-12K+10%FBS三種培養(yǎng)基培養(yǎng)。擴培至T75培養(yǎng)瓶后,待細胞生長狀態(tài)良好,進行流式細胞儀分析,結果見圖8。培養(yǎng)基中加入血清后,有50%左右的陰性細胞轉變?yōu)殛栃约毎?。以上結果都可以證明,在對2C3細胞懸浮培養(yǎng)的過程中,ZsGreen1基因并沒有因細胞分裂、生長而丟失,通過優(yōu)化懸浮馴化的培養(yǎng)基和培育條件,有望提高目的蛋白的表達量。

表2 2C3陰性細胞PCR擴增后片段測序結果Table 2 Fragment sequencing results of PCR amplification of 2C3 negative cells

圖8 血清影響陰性2C3細胞表達ZsGreen1蛋白的驗證Fig.8 Effect of serum on the ZsGreen1 protein expression in the negative 2C3 cells

2.5 ZsGreen1基因的轉錄水平驗證

作者推測血清可能在轉錄水平上影響了蛋白表達,所以提取了在培養(yǎng)基M2M4、M2M4+10%FBS和F-12K+10%FBS中擴培的3組陰性細胞以及M2M4培養(yǎng)的陽性細胞的RNA,反轉錄成cDNA后,進行了Q-PCR實驗,以GAPDH為內參。已經適應懸浮培養(yǎng)的細胞在F-12K+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,mRNA含量稍高于對照組,而在培養(yǎng)基M2M4中加入血清后,ZsGreen1蛋白的mRNA含量明顯提高,也稍高于同時收集的陽性細胞,見圖9。

圖9 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下2C3細胞內ZsGreen1的mRNA表達量的變化Fig.9 ZsGreen1 mRNA content in 2C3 cells cultured in different culture media

3 結語

應用定點整合的方法構建CHO工程細胞系,可以快速將外源基因插入宿主細胞基因組的特定位置,從而避免傳統(tǒng)的隨機整合方法帶來的耗時費力、“位置效應”等問題。為了能挑選出相對穩(wěn)定、高表達目的蛋白的細胞株,初始整合位點的選擇尤其重要。

前期作者應用慢病毒示蹤報告基因技術以及染色體步移技術,在CHO-K1細胞株中,尋找到了可以持續(xù)表達綠色熒光標簽ZsGreen1的基因組內位點,測序結果明確了該整合位點為Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處[9]。本實驗中主要使用倒置熒光顯微鏡和流式細胞術,以細胞熒光強度為指標,定量分析ZsGreen1報告基因的表達情況。通過對2C3細胞以貼壁和懸浮兩種不同的培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng),可以確定NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點用于外源基因的穩(wěn)定表達。

在實際工業(yè)生產過程中,生產細胞庫擴增到大生產罐需要45~50代次,所以本研究中的穩(wěn)定性評價以連續(xù)傳代50次為實驗終點,觀察目的基因的表達情況。2C3細胞貼壁培養(yǎng)連續(xù)傳代50代次,100%的細胞可以穩(wěn)定表達ZsGreen1報告基因。無血清懸浮馴化培養(yǎng)2C3細胞時,倒置熒光顯微鏡觀察到細胞平均熒光強度明顯降低,但連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)60代次,熒光細胞數目顯著增多。在懸浮培養(yǎng)基中添加體積分數10%FBS后,懸浮培養(yǎng)的細胞池中ZsGreen1陽性細胞比例上升到95%以上。流式細胞術分選細胞池中高、低表達ZsGreen1蛋白的2C3細胞,可以確定細胞分裂生長過程中沒有丟失ZsGreen1基因,培養(yǎng)環(huán)境的改變影響了基因表達水平,猜測細胞在營養(yǎng)匱乏時優(yōu)先表達必需基因,關閉了非必需基因的表達以滿足生長需求,當營養(yǎng)充足時重新開啟。通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,比如在懸浮培養(yǎng)基中添加血小板裂解液、植物水解素等增加培養(yǎng)基的營養(yǎng),有望提高目的蛋白質的表達量。無血清基礎培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基和無血清基礎培養(yǎng)基逐步取代完全培養(yǎng)基這兩種不同的懸浮馴化方法,不會造成細胞生長和外源蛋白表達的明顯差異,推薦使用直接替換的馴化方法更能縮短馴化時間。

目前,作者以CHO-K1為出發(fā)細胞株,使用CRISPR/Cas9介導的定點整合技術,在該位點成功敲入了生物藥市場上有代表性的3種治療性蛋白質基因：人血清白蛋白(HSA,68 000)的基因、胰高血糖素樣肽-1突變雙聯(lián)體-人血清白蛋白(HSANGG,75 000)的基因和靶向VEGF人源化抗體(VEGF-hAb,150 000)輕重鏈的基因[10-11],在連續(xù)的貼壁和懸浮傳代培養(yǎng)中,細胞均可以表達對應蛋白質,進一步驗證了該位點的適用度。綜上,Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點成為研究人員構建CHO工程細胞株的可靠選擇。