油莎豆發(fā)芽前后營養(yǎng)成分及多糖生物活性的變化

巢曉玲，黎揚(yáng)輝，敬思群, ，翟紅月，劉根梅，張俊艷，祁 鯤，朱新亮,，布威佐合熱·艾科熱木

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2.河南亞臨界萃取技術(shù)研究院有限公司，河南安陽 455000；3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046）

油莎豆（Cyperus esculentusL.Var.sativus）又名油莎果、鐵荸薺、人參果、人參豆，是莎草科（Cyperaceae）莎草屬（Cyperus）多年生草本植物[1]，目前在我國新疆、內(nèi)蒙、河南、河北、東北已經(jīng)大面積種植。油莎豆中的脂肪占20%～30%，淀粉占25%～30%（其中支鏈淀粉占66%，直鏈淀粉占24%），糖15%～20%（其中蔗糖占90%，葡萄糖和果糖占10%），蛋白質(zhì)占3%～10%，富含17 種人體需要的氨基酸以及豐富的胡蘿卜素等。油莎豆粕蛋白的氨基酸組成接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白，營養(yǎng)價(jià)值接近雞蛋[2]，素有“地下板栗”和“地下核桃”之美稱。其產(chǎn)量遠(yuǎn)高于小麥、玉米等大宗農(nóng)作物，每畝油莎草可產(chǎn)油莎豆1000 kg，產(chǎn)干飼草900 kg。目前的研究表明，油莎豆具有抑菌性[3?4]、抗氧化性[5?6]、調(diào)節(jié)細(xì)胞外ATP 和腺苷的代謝[7]、促進(jìn)微循環(huán)和抗凝血活性作用[8]、調(diào)節(jié)大鼠的性行為[9]、預(yù)防高脂飲食引起的肥胖和高脂血癥[10]、抗糖尿病[11]和干預(yù)缺血性腦中風(fēng)[12]等生物活性，油莎豆粉作為起酥油應(yīng)用于無麩質(zhì)面包還可對食用機(jī)體起到胃腸保護(hù)的作用[13]。因此，與同類油料作物相比較，油莎豆的經(jīng)濟(jì)效益和剩余附加值的再利用是其他油料作物的十幾倍。

發(fā)芽過程中一系列復(fù)雜的生化和理化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)的變化[14?15]，產(chǎn)生促進(jìn)身體健康預(yù)防疾病發(fā)生的成分[16]，發(fā)芽可作為改善食品營養(yǎng)價(jià)值和增強(qiáng)生物活性的有效技術(shù)手段之一[17?18]。發(fā)芽豆類在數(shù)千年前就開始流行于東方國家，在西方市場也有銷售。研究表明，通過發(fā)芽處理豆類可以改善它們的口感，提高營養(yǎng)成分的含量和利用率，降低抗?fàn)I養(yǎng)成分的含量[19?20]。Guzmán-Ortiz 等[21]發(fā)現(xiàn)在大豆發(fā)芽的過程中增加了生物活性酚類化合物和異黃酮苷元含量，增強(qiáng)了大豆的功能特性。楊天等[22]研究了5 個(gè)品種花生發(fā)芽5 d 過程中營養(yǎng)成分和生物活性成分的變化，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，小肽、游離氨基酸和可溶性糖含量顯著增加，γ－氨基丁酸和白藜蘆醇的含量急劇增加。若能通過發(fā)芽修飾油莎豆的營養(yǎng)成分組成和植物化學(xué)成分，并加工成一定功能的食品，則必將拓展油莎豆的應(yīng)用市場。本文通過對發(fā)芽前后油莎豆的營養(yǎng)成分、多糖抗氧化性及降糖活性的比較分析，揭示發(fā)芽對油莎豆?fàn)I養(yǎng)成分和油莎豆多糖生物活性的影響及機(jī)制，為油莎豆的產(chǎn)業(yè)化加工及相關(guān)功能食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油莎豆 吉林省好易收農(nóng)牧業(yè)科技開發(fā)有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度>97%）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，純度>98%）、抗壞血酸（VC，UV≥99.8%） 上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯基-β-D 吡喃半乳糖苷（PNPG） 上海麥克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（α-D-g1ucosidase，來源于黑曲霉） 北京索萊寶科技有限公司；阿卡波糖 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；葡萄糖 優(yōu)級(jí)純，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司；蒽酮、濃硫酸、石油醚、正丁醇、氯仿、無水乙醇、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鐵等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海雅萊生化設(shè)備儀器有限公司；SHE-3000G 全波長多功能酶標(biāo)分析儀 北京塞爾福知心科技有限公司；日立L-8800 型自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi 公司；ICS 5000 多功能離子色譜 美國Dionex 公司；Spectra Star XT Chem Tron 近紅外光譜分析儀 優(yōu)萊技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油莎豆發(fā)芽操作要點(diǎn) 參照楊偉波等[23]的方法。選取飽滿成熟、沒有破損且顆粒大小相近的油莎豆塊莖，用70%的乙醇浸泡3 min，倒出乙醇后用蒸餾水清洗3 次。將盛有500 mL 蒸餾水的大燒杯置于水浴鍋內(nèi)加熱至35 ℃，將塊莖放入燒杯中，10 min 后，取出燒杯后立即加入蒸餾水使其降溫至室溫，于室溫浸種24 h，期間換水4 次。將浸種處理后的塊莖放在鋪有兩層黃紙的盤子中，加水至塊莖高度的1/4，自然光照，環(huán)境溫度在30 ℃左右，每天換水3 次至發(fā)芽。

1.2.2 營養(yǎng)成分含量測定 油莎豆粉制備：將發(fā)芽24 h 后的油莎豆塊莖、發(fā)芽前的塊莖分別置于45 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘24 h，粉碎，過60 目篩，待測。

參考檀其梅等[24]的方法，采用近紅外光譜分析儀，儀器預(yù)熱2 h，校準(zhǔn)后放經(jīng)烘箱烘干的樣品，按照UScan 操作說明書選擇檢測模型。將樣品混勻后用1/2 樣品杯裝填樣品,樣品深度不低于2 mm。采用ISIScan 軟件操作NIR 系統(tǒng)設(shè)備，待儀器穩(wěn)定后，運(yùn)行Check cell 標(biāo)準(zhǔn)測試槽，結(jié)果正常后開始掃描樣品，直接預(yù)測80%能過60 目篩的發(fā)芽前后油莎豆粉末的水分、脂肪、蛋白質(zhì)、灰分、纖維和淀粉的含量。油莎豆近紅外校準(zhǔn)曲線由優(yōu)萊技術(shù)公司提供建模，在韶關(guān)學(xué)院品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行曲線校正，結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析。

1.2.3 油莎豆多糖制備工藝

1.2.3.1 傳統(tǒng)水提醇沉法 油莎豆→干燥→粉碎→脫脂→熱水浸提→濃縮→脫蛋白→離心→醇沉→凍干

操作要點(diǎn)：精確稱取10 g 已過60 目篩的干燥油莎豆粉末，加入1.67 倍虹吸量的石油醚，脫脂至用濾紙檢查至無油跡，揮干石油醚后，將樣品放入平底燒瓶中，加入200 mL 的蒸餾水，于82 ℃恒溫水浴鍋中加熱2 h，濾紙過濾，濾渣加蒸餾水重復(fù)提取，提取時(shí)間為前一次的1/2，重復(fù)三次。將三次提取的濾液濃縮至100 mL，Sevage 法去蛋白，重復(fù)三次至無蛋白層。加入5 倍體積95%乙醇，于4 ℃冰箱過夜（12 h），沉淀的多糖用無水乙醇清洗三次，冷凍干燥后稱量備用。

1.2.3.2 酶解超聲輔助法 油莎豆→干燥→粉碎→脫脂→酶解→控溫超聲→熱水浸提→濃縮→脫蛋白→離心→醇沉→凍干

操作要點(diǎn)：將10 g 脫脂后的油莎豆粉末以料液比1:20 加水溶解，樣品溶液用磷酸氫二鈉-檸檬酸調(diào)節(jié)pH6.5，加入1.2%α-淀粉酶，于50 ℃恒溫水浴鍋中保持30 min，后于95 ℃下鈍酶5 min。將樣品溶液置于40 ℃控溫超聲處理10 min，后熱水浸提[23]。其余操作同1.2.3.1。

1.2.4 抗氧化活性評(píng)價(jià) 油莎豆多糖母液的制備：精確稱取1 g 油莎豆多糖，蒸餾水定容至100 mL，即得10 mg/mL 的樣品液。以抗壞血酸（VC）為陽性對照。

DPPH·清除能力分析：參照J(rèn)ing 等[5]方法。清除率計(jì)算公式如下：清除率（%）=［1?(A1?A2)/A0］×100，式中：A0：2 mL 蒸餾水與2 mL DPPH 乙醇混合溶液的吸光度；A1：2 mL 樣品液與2 mL DPPH 乙醇混合液的吸光度；A2：2 mL 樣品液與2 mL 無水乙醇混合液的吸光度。

ABTS+·能力分析：參照FLoegel 等[25]的方法。清除率（%）=[1?(A1?A2)/A0]×100，式中：A0為0.2 mL蒸餾水與1.9 mL ABTS+·溶液反應(yīng)后的吸光度值；A1為0.2 mL 樣品液與1.9 mL ABTS+·溶液反應(yīng)后的吸光度值；A2為0.2 mL 樣品液與1.9 mL 無水乙醇混合后的吸光度值。

總抗氧化能力分析：參照J(rèn)ing 等[5]的方法?？傔€原能力用WA來表示（WA=A?A0），式中：A：樣品組吸光度；A0：空白組吸光度。

1.2.5 對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用分析 參照趙元[26]的方法（PNPG 法）進(jìn)行，α-葡萄糖苷酶催化PNPG 水解，釋放對硝基酚（PNP）。通過檢測405 nm PNP 的量計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性。在96 孔板中，加入不同濃度的油莎豆粗多糖樣品溶液40 μL，0.355 mg/mLα-葡萄糖苷酶40 μL，50 ℃保溫5 min后，加入0.754 mg/mL pNPG 溶液20 μL，反應(yīng)30 min，用0.1 mol/L Na2CO3溶液100 μL 終止反應(yīng)?？瞻讓φ沼镁彌_液代替供試液。將反應(yīng)液置于酶標(biāo)儀405 nm 波長下測定吸光度，每個(gè)樣品同時(shí)作3 個(gè)平行試驗(yàn)。以阿卡波糖為陽性對照。

酶活性抑制率（%）=[1?（A1?A2）/A0]×100

式中：A0：不加待測樣品反應(yīng)后吸收值；A1：加入待測樣品反應(yīng)后吸收值；A2：只加待測樣品吸收值。

1.2.6 分析測定

1.2.6.1 多糖得率計(jì)算 多糖含量測定采用蒽酮-硫酸比色法[27]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程：在6 支具塞管中分別加入0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補(bǔ)水至2 mL，加5 mL 2mg/mL 蒽酮-硫酸混合液，冰水降溫，95 ℃水浴10 min，冰水降至常溫，于620 nm 處測吸光度?；貧w方程為A=9.3857C+0.0932，R2=0.9984，線性范圍0.0～0.05 mg/mL。

按下式計(jì)算油莎豆多糖含量：

式中：C—樣品OD 值得到的糖含量的微克數(shù)；Vt—供試樣品的總體積（mL）；V—取試樣品體積（mL）；M—粗多糖干重（mg）。

1.2.6.2 氨基酸含量分析 采用氨基酸分析儀分析發(fā)芽前后油莎豆氨基酸組成及含量。精確稱取油莎豆樣品于水解管中，按料液比1:6 加入6 mo1/L 鹽酸溶液，然后真空封管，并于110 ℃水解24 h，過濾后繼續(xù)真空干燥，后加入1 mL（0.01 mol/L）鹽酸，放置30 min 后待測。色氨酸的水解條件為4 mol/L 氫氧化鈉溶液，110 ℃水解20 h，冷卻調(diào)節(jié)pH 為5～6 后定容。氨基酸分析系統(tǒng)測定。

1.2.6.3 發(fā)芽前后油莎豆多糖的單糖組成分析 參考Jing 等方法[28]。采用配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜（HPAEC-PAD）技術(shù)分析單糖組成。樣品水解：經(jīng)脫蛋白、透析后的油莎豆多糖用去離子水配成10 mg/mL 的溶液，然后用3 mol/L 硫酸水解2 h，碳酸鋇中和后得清液，稀釋50 倍后進(jìn)樣分析。單糖標(biāo)樣：1～10 號(hào)峰依次為巖藻糖（Fuc），阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rham）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、果糖（Fru）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）。

色譜條件：色譜柱：CarboPac PA-20 陰離子交換柱，包括分離柱（3 mm×150 mm）和保護(hù)柱（3 mm×50 mm）；檢測器：脈沖安培電化學(xué)檢測器；工作電極：金電極；參比電極：Ag/AgCl；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃；淋洗液：超純水（A）、0.25 mol/L NaOH 溶液（B）和1 mol/L NaAc 溶液（C）進(jìn)行三元梯度淋洗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽對油莎豆?fàn)I養(yǎng)成分的影響

由表1 可知，出現(xiàn)發(fā)芽后再繼續(xù)生長24 h，然后分析營養(yǎng)成分的含量，發(fā)現(xiàn)油莎豆蛋白含量降低了11.09%，其原因是由于發(fā)芽前的浸泡（包括浸種），塊莖中的可溶性氮溶于水中，另一方面，種子在剛萌動(dòng)時(shí)要消耗一部分蛋白質(zhì)，故發(fā)芽24 h 時(shí)，蛋白質(zhì)含量減少；淀粉含量降低了11.75%，因?yàn)榘l(fā)芽時(shí)，豆類內(nèi)源淀粉酶被激活，導(dǎo)致淀粉發(fā)生降解，引起直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的下降，淀粉在淀粉酶的作用下逐步分解為葡萄糖等小分子糖類，所以淀粉含量逐漸減少[29]，另外，灰分和纖維含量分別降低了7.69%和10.31%。發(fā)芽24 h 后脂肪含量上升了8.22%，說明有脂肪被合成，油莎豆中含有25%～30%的淀粉，此時(shí)淀粉分解產(chǎn)生的糖源大量增加，促使了新的脂肪合成[30?31]。

表1 發(fā)芽前后油莎豆?fàn)I養(yǎng)成分含量（干基計(jì)）Table 1 Nutrient content of C.esculentus L.before and after germination (in terms of the dry basis)

2.2 發(fā)芽對油莎豆多糖得率影響

由表2、表3 可知，采用不同的提取方法都發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽后的油莎豆多糖含量及提取率皆高于發(fā)芽前的，這是由于油莎豆的萌發(fā)降解了淀粉，積累的糖類物質(zhì)，使得提取的粗多糖糖含量增加。另一方面發(fā)現(xiàn)，以酶解超聲輔助提取法的油莎豆多糖含量及得率比傳統(tǒng)水提醇沉法高，這是可能是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械振動(dòng)及空化效應(yīng)，破壞了細(xì)胞壁，加速了多糖的溶出。因此后面的體外抗氧化及降糖實(shí)驗(yàn)以酶解超聲輔助法提取的油莎豆多糖作為試驗(yàn)樣品，以傳統(tǒng)水提法的多糖做比較。

表2 不同方法提取油莎豆多糖含量（%）Table 2 Contents of C.esculentus L.polysaccharide extracted by different methods (%)

表3 不同方法提取的油莎豆多糖的得率（%）Table 3 Yield of C.esculentus L.polysaccharide extracted by different methods (%)

2.3 發(fā)芽對油莎豆氨基酸含量的影響

由表4 油莎豆發(fā)芽前后氨基酸組成可知，發(fā)芽前后氨基酸總和分別為4.21 g/100 g 和4.56 g/100 g，發(fā)芽使氨基酸總量提高了8%；必需氨基酸（色氨酸除外）總和發(fā)芽前后分別為1.07 g/100 g 和1.09 g/100 g，這是由于油莎豆在發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)在水解酶的作用下被大量分解成小分子氨基酸所致。這與張雨薇等[30]的研究一致。

表4 油莎豆發(fā)芽前后氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition of C.esculentus L.before and after germination

2.4 發(fā)芽前后油莎豆多糖的單糖組成

發(fā)芽前后油莎豆多糖的單糖組成見圖1。

圖1 10 個(gè)單糖標(biāo)樣及發(fā)芽前后油莎豆多糖完全水解產(chǎn)物的HPAEC 分析圖Fig.1 HPAEC analysis diagram of 10 standard monosaccharides and completely hydrolyzatet of C.esculentus L.polysaccharide before and after germination

將樣品與標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行對照，確定多糖的單糖組成種類。并根據(jù)面積歸一化法定量計(jì)算出多糖中的單糖組成。發(fā)芽前油莎豆多糖的單糖組成為0.59%鼠李糖（Rham）、0.85%半乳糖（Gal）、98.55%葡萄糖（Glc），發(fā)芽后為0.78%鼠李糖（Rham）、0.61%半乳糖（Gal）、98.61%葡萄糖（Glc）。發(fā)芽使鼠李糖的含量明顯提高了，而鼠李糖有較強(qiáng)的抗氧化活性[31]。

2.5 發(fā)芽對油莎豆多糖體外抗氧化活性的影響

由圖2～圖4 可知，酶解超聲輔助法提取的發(fā)芽前、后的油莎豆多糖DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力及總抗氧化能力均強(qiáng)于傳統(tǒng)水提醇沉法，且皆呈一定的量效關(guān)系；酶解超聲輔助提取法提取的油莎豆多糖濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，發(fā)芽前對DPPH·清除率為24.17%，發(fā)后則為30.11%；發(fā)芽前對ABTS+·清除率為33.33%，發(fā)芽后為39.61%；發(fā)芽油莎豆多糖的總抗氧化能力強(qiáng)于發(fā)芽前的，因此發(fā)芽提高了油莎豆多糖的抗氧化能力，這是由于發(fā)芽過程使有較強(qiáng)的抗氧化活性的鼠李糖的含量明顯提高了，這與徐磊[32]的研究發(fā)現(xiàn)一致。

圖2 發(fā)芽對油莎豆多糖清除DPPH·能力的影響Fig.2 Effects of germination on DPPH· scavenging ability of C.esculentus L.polysaccharide

圖3 發(fā)芽對油莎豆多糖清除ABTS+·能力的影響Fig.3 Effects of germination on the ABTS+· scavenging ability of C.esculentus L.polysaccharide

圖4 發(fā)芽對油莎豆多糖總抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of germination on the total antioxidant capacity of C.esculentus L.polysaccharide

2.6 發(fā)芽對油莎豆多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖5 可知，酶解超聲輔助法提取的發(fā)芽前、后的油莎豆多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用均弱于傳統(tǒng)水提醇沉法提取。當(dāng)樣品濃度為0.10 mg/mL 時(shí)，酶解超聲輔助提取的發(fā)芽前的油莎豆多糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為25.42%，而發(fā)芽后的為30.51%，發(fā)芽使油莎豆多糖降糖活性增強(qiáng)了。

圖5 發(fā)芽對油莎豆多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effects of germination on the inhibition of α-glucosidase activity by C.esculentus L.polysaccharide

綜上，發(fā)芽提高了油莎豆多糖的抗氧化劑降糖活性，這是由于發(fā)芽改變了油莎豆多糖的單糖組成比例，使鼠李糖的含量明顯提高了，而鼠李糖有較強(qiáng)的抗氧化活性[31]。

2.7 相關(guān)性分析

由表5 可知，油莎豆的多糖含量與DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、總抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性均具有極顯著正相關(guān)性（P<0.01），相關(guān)系數(shù)范圍為r=0.986～0.998，推測可能是因?yàn)榘l(fā)芽改變了油莎豆多糖的單糖組成比例，從而引起其抗氧化性及降糖活性的變化。

表5 濃度與抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of concentration with antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory activity

3 結(jié)論

發(fā)芽對油莎豆各營養(yǎng)成分的含量影響有一定差異，蛋白質(zhì)、灰分、纖維和淀粉的含量發(fā)芽降低了，發(fā)芽使氨基酸總量提高了8%，脂肪的含量提高了，這與種子發(fā)芽過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和脂肪合成有關(guān)；發(fā)芽后油莎豆多糖對DPPH·、ABTS+·的IC50值分別為（3.516±2.369）、（1.274±0.285）mg/mL（發(fā)芽前為（8.363±2.785）、（2.824±1.09）mg/mL），其總抗氧化能力0.27（發(fā)芽前為0.26）；發(fā)芽后油莎豆對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值為（344.2±150.6）mg/mL，而發(fā)芽前為（696.6±222.6）mg/mL，發(fā)芽提高了油莎豆多糖的抗氧化及降糖活性，采用離子色譜分析發(fā)現(xiàn)發(fā)芽過程改變了油莎豆多糖的單糖組成比例，產(chǎn)生了更多的抗氧化活性較強(qiáng)的組分鼠李糖，這為油莎豆的深加工和功能化產(chǎn)品的開發(fā)提供了科學(xué)借鑒和思路；相關(guān)性分析表明，油莎豆發(fā)芽后強(qiáng)的抗氧化能力、降糖作用與高的多糖含量呈極顯著相關(guān)性（r=0.985～0.997）。在規(guī)范化發(fā)芽和規(guī)模化的發(fā)芽關(guān)鍵技術(shù)及裝備開發(fā)方面值得做進(jìn)一步的研究。